Мдф аббревиатура расшифровка: расшифровка, свойства, виды, применение материала

МДФ расшифровка

МДФ в настоящее время является одним из самых распространенных древесных материалов. Его можно найти в мебели, дверях, а так же он активно используется при отделке различных поверхностей.

Многие сравнивают МДФ с ДВП (древесно-волокнистая плита). Отчасти, такое сравнение уместно, так как свойства материалов во многом схожи, но МДФ характеризуется более продвинутой технологией производства и более высоким качеством.

МДФ – расшифровка

По-хорошему, правильнее будет MDF, так как это аббревиатура от английских слов: Medium Density Fiberboard или древесноволокнистая плита средней плотности.

Состав

Состав и технология производства МДФ очень схожи с ДВП. Сухие волокна древесины смешиваются с синтетическими клеящими веществами. Полученная масса прессуется под воздействием повышенной температуры, после чего шлифуется. Таким образом, получается плита МДФ.

Для склеивания частиц используют особые типы смол, которые практически не испаряются после прессования и термической обработки.

Одним из ключевых преимуществ МДФ перед ДВП и тем более ДСП – крайне низкий уровень содержания ядовитых формальдегидов. Благодаря этому, показатель экологической безопасности МДФ значительно выше, чем у аналогов.

Основные свойства

• Отличная механическая прочность. Благодаря ей материал нашел широкое применение в мебельной промышленности. Ведь МДФ не только отлично сохраняет форму мебели, но и хорошо держит крепежные элементы.
• Водостойкость. Конечно, она несопоставима с водостойкостью пластмасс, но выше чем у натуральной древесины.
• Обрабатываемость. МДФ отлично режется, шлифуется и обрабатывается иным инструментом. Это позволяет создавать любые геометрические формы на основе МДФ панелей, открывая широкие возможности по дизайнерскому оформлению тех или иных элементов.
• Биологическая устойчивость. Высокая плотность и пропитка полимерным клеящим составом делает МДФ почти полностью неприспособленной для жизни микроорганизмов. Отсюда, отсутствие проблем с плесень, гниением и грибком.

Применение

Основное направление использования МДФ – мебельное производство, а точнее: изготовление декоративных элементов мебели и фасадов. Ламинирование МДФ с помощью ПВХ пленки позволяет придать поверхности практически любой дизайн и симпатичный глянец. Благодаря хорошей обрабатываемости, МДФ так же ценится там, где необходимо выполнять сложную резьбу.

Не менее распространено использование панелей МДФ для отделки межкомнатных дверей. Во входных дверях конструкции на основе МДФ применяются редко, так как металл здесь вне конкуренции.

Так же данный материал активно применяется при изготовлении напольных покрытий и стеновых панелей. Последние часто используются при отделочных работах, как альтернатива гипсокартону.

Наконец, МДФ применяется при изготовлении различных небольших элементов отделки: наличников, карнизов и т.д. Кроме того, из него нередко делают корпуса звуковоспроизводящей аппаратуры (колонок).

Мдф — что это такое (расшифровка)

На сегодняшний день плиты МДФ получили широчайшее распространение. Из этого материала производят мебель, двери для комнат, электротехнические плинтуса и многое другое.

Что такое МДФ?

Аббревиатура МДФ произошла от сокращения англоязычного названия материала — Medium Density Fiberboard. Если перевести эту фразу на русский язык, то получится что МДФ — это плита из волокон древесины со средней плотностью.

В процессе изготовления МДФ используются стружки дерева, которые обрабатываются специальными связывающими веществами. Под воздействием давления и температур происходит спрессовывание волокон дерева, что позволяет получить плиту с высокими эксплуатационными свойствами.

Подобная технология использовалась для изготовления ДВП (древесноволокнистой плиты). Её усовершенствовали, благодаря чему стало возможным получить более прочный материал. По своей сути МДФ и ДВП это практически один и тот же материал, изготовленный по различным технологиям.

Сферы применения МДФ

Плиты из прессованных стружек стали довольно популярным материалом во многих сферах. В первую очередь благодаря своей низкой стоимости. Этот материал значительно легче дерева, что позволяет расширить области традиционного применения пиломатериалов.

Чаще всего изделия из МДФ можно встретить:

• в мебельной промышленности. Современные технологии позволяют сделать древесные плиты внешне очень схожими с натуральным деревом. Мебель, изготовленная из этого материала, выглядит очень эффектно, при этом значительно дешевле той, что изготовлена из массива дерева;
• в строительной отрасли. МДФ часто используют при производстве напольных покрытий (ламината), для изготовления и отделки дверей, а также в качестве стеновых панелей и многого другого;
• в электротехнической промышленности. Например, большинство акустических систем изготавливают из плит МДФ;
• дизайнеры интерьеров очень часто в своей работе используют этот материал для создания эксклюзивных предметов.

Широкое использование МДФ в производстве детской мебели обеспечивает её экологичность. При изготовлении стружечных плит не используются вещества, содержащие фенол. Смолы, служащие для связки волокон, идентичны натуральным смолам дерева.

Смотрите также:

Канализация септик — что это такое http://domkrat.org/kanalizatsiya-septik-chto-eto-takoe/.

Интересное по теме: Как выбрать светодиодную лампу по мощности

Советы в статье «Как сделать фонтан на даче» здесь.

МДФ или ДСП что лучше? Преимущества и недостатки смотрим в видео:

Tweet

МДФ панели — что это такое и где используют? Расшифровка аббревиатуры |

Плита (панель) МДФ — это древесноволокнистая плита средней плотности, расшифровка от английской аббревиатуры MDF (Medium Density Fibreboard). Материал  превосходит по своим характеристикам и долговечности такие материалы как  ДСП, ДВП.

МДФ панели уже давно стали обширно использоваться в строительной сфере. Связано это с их неотъемлемыми преимуществами, такими как, долговечность, качество, симпатичный вид, легкость установки, термоизоляция и шумоизоляция. МДФ панели, не требуют дополнительного ухода, что намного упрощает их эксплуатацию. Панели МДФ легко демонтируются в случае изменения интерьера, кроме того, они не впитывают грязь и устойчивы к солнечному излучению.

Плюсы использования панелей и плит МДФ

Панели МДФ, имеют много положительных сторон, при сравнении с прочими материалами строительства. Одной  из них, можно назвать универсальность использования, так как их монтаж возможен и уместен, как в квартире, так и в кабинете или   столовой, в любом варианте МДФ плита, будет смотреться презентабельно и обеспечит хорошую теплоизоляцию и звукоизоляцию. Следующим плюсом, является легкость в использовании, по мере надобности, Вы можете произвести замену покоробленного листа — новым. Если Вы приняли решение применить в оформлении помещения стеновые МДФ плиты, то Вам не потребуется тратить время и силы на сглаживание стенки, снимать старую штукатурку, обои и пр. Не надо также, иметь большой опыт и особые инструменты для работы с МДФ панелями, их с легкостью может установить один человек самостоятельно.

Цена МДФ панелей, также радует, они доступны для любого человека.  Решившись установить подобную конструкцию, человек, сберегает свое время и средства. Используются панели  МДФ, не только лишь для отделки стенок, Вы с легкостью сможете установить их на веранде, балконе или потолке. Обилие палитры декоров, позволит подобрать желаемый дизайн и воплотить его в реальность. Панели МДФ, выполняются из  высококачественного материала, который производится на базе натурального дерева. Вот поэтому этот материал применяется при отделке, практически любых комнат, как в офисе, так и в доме. Такой материал, пользуется спросом, из-за своей экологичности и  практичности.

Внешний вид панелей МДФ напоминает собой натуральное дерево, но в отличие от дерева ,на нем не имеется трещинок ,сучков и прочих похожих недостатков. Если хозяевам будет не по вкусу отделка помещения «под дерево», всегда есть возможность  купить и установить плиты МДФ, имитирующие различные варианты гранита или мрамора. Панели МДФ, дают возможность  создать современный и элегантный интерьер, который всегда будет Вас радовать своей элегантностью и прослужит Вам большое количество лет.

Если Вас интересуют межкомнатные двери — обратите внимание на двери профиль дорс. Межкомнатные двери компании Profil Doors отличаются оптимальным отношением цена/качество. Нестандартный дизайн дверей позволит выделить Ваш интерьер среди многочисленных унылых «шаблонов» идеального интерьера.

Статьи по теме

Мдф — что это такое (расшифровка)

На сегодняшний день плиты МДФ получили широчайшее распространение. Из этого материала производят мебель, двери для комнат, электротехнические плинтуса и многое другое.

Что такое МДФ?

Аббревиатура МДФ произошла от сокращения англоязычного названия материала — Medium Density Fiberboard. Если перевести эту фразу на русский язык, то получится что МДФ — это плита из волокон древесины со средней плотностью.

В процессе изготовления МДФ используются стружки дерева, которые обрабатываются специальными связывающими веществами. Под воздействием давления и температур происходит спрессовывание волокон дерева, что позволяет получить плиту с высокими эксплуатационными свойствами.

Подобная технология использовалась для изготовления ДВП (древесноволокнистой плиты). Её усовершенствовали, благодаря чему стало возможным получить более прочный материал. По своей сути МДФ и ДВП это практически один и тот же материал, изготовленный по различным технологиям.

Сферы применения МДФ

Плиты из прессованных стружек стали довольно популярным материалом во многих сферах. В первую очередь благодаря своей низкой стоимости. Этот материал значительно легче дерева, что позволяет расширить области традиционного применения пиломатериалов.

Чаще всего изделия из МДФ можно встретить:

• в мебельной промышленности. Современные технологии позволяют сделать древесные плиты внешне очень схожими с натуральным деревом. Мебель, изготовленная из этого материала, выглядит очень эффектно, при этом значительно дешевле той, что изготовлена из массива дерева;
• в строительной отрасли. МДФ часто используют при производстве напольных покрытий (ламината), для изготовления и отделки дверей, а также в качестве стеновых панелей и многого другого;
• в электротехнической промышленности. Например, большинство акустических систем изготавливают из плит МДФ;
• дизайнеры интерьеров очень часто в своей работе используют этот материал для создания эксклюзивных предметов.

Широкое использование МДФ в производстве детской мебели обеспечивает её экологичность. При изготовлении стружечных плит не используются вещества, содержащие фенол. Смолы, служащие для связки волокон, идентичны натуральным смолам дерева.

Смотрите также:

Канализация септик — что это такое /kanalizatsiya-septik-chto-eto-takoe/.

Интересное по теме: Как выбрать светодиодную лампу по мощности

Советы в статье «Как сделать фонтан на даче» здесь.

МДФ или ДСП что лучше? Преимущества и недостатки смотрим в видео:

Расшифровка аббревиатур отделочных материалов

Если для человека знакомого с отделочными работами расшифровка аббревиатур названий отделочных материалов никакой тайны не представляет, то для многих людей, впервые затеявших ремонт в своей квартире или доме, совсем не понятно, что означают буквы, написанные в инструкциях и рекомендациях по применению или монтажу материалов отделки.

Мы постараемся помочь новичкам разобраться, что означает аббревиатура основных, на наш взгляд, отделочных материалов, востребованных в настоящее время.

ГВЛ – гипсоволокнистый лист

ГВЛВ – гипсоволокнистый лист влагостойкий

ГВЛВ (DIY) – влагостойкий лист малоформатный

ГВЛВ ЭП – суперпол (ЭП — элемент пола)

ГКЛ – гипсокартонный лист

ГКЛВ – гипсокартонный лист влагостойкий

ГКЛО – огнестойкий лист

ГКЛВО – влагостойкий лист с повышенной стойкостью к огню

ДВП – древесно-волокнистая плита

ДСП – древесно-стружечная плита

ЗИПС – звукоизоляционная система сэндвич-панелей

ЛДСП – ламинированная древесно-стружечная плита

ЛКМ – лакокрасочные материалы

МДФ – древесно-волокнистая плита средней плотности

ОСП – ориентированно-стружечная плита

ПВХ – поливинилхлорид

ПН – профиль направляющий

ПНП – потолочный направляющий профиль

ПП – потолочный профиль

ПС – профиль стоеный

ПУ – профиль угловой

СП – стеновые панели

ФК — фанера водостойкая

ФСФ – фанера повышенной водостойкости

ЦСП – цементно-стружечная плита

Естественно, что эта расшифровка аббревиатур, используемых в наименованиях отделочных материалов, далеко не полная, но, что означают буквы на основных материалах отделки, вы, надеемся, уже запомнили.

расшифровка абривиатуры МДФ

Это плитный материал, изготовленный из высушенных древесных волокон, обработанных синтетическими связующими веществами и сформированных в виде ковра с последующим горячим прессованием (плотностью 700…870 кг/ м3) и шлифовкой.

МДФ (MDF) возникли как дальнейшее развитие сухого способа производства ДВП с учетом совершенствовавшихся при изготовлении ДВП технологий. Аббревиатура МДФ (MDF) представляет собой кальку с английского МДФ (MDF) — Medium Density Fiberboard. В ДВП средней плотности развитая поверхность древесных волокон и сокращенный цикл прессования эффективно сочетаются с прочностью за счет участия связующих веществ в межволоконном взаимодействии.

Словосочетание МДФ (MDF) используется как альтернатива всем известному понятию ДВП — древесно-волокнистая плита. По сути дела, являясь одним и тем же, МДФ (MDF) отличается от ДВП технологией производства, которая обеспечивает новые качественные характеристики этого материала. Плита изготавливается методом сухого прессования мелко-дисперсной древесной стружки в условиях высокого давления и температуры. Связующим элементом является лигнин, который выделяется при нагревании древесины.

При более низкой стоимости по своим экологическим и качественным характеристикам МДФ близок к натуральной древесине, что обеспечивает его широкое применение.

Прочность МДФ обеспечивается не только использованием синтетических смол, но и участием естественных связующих веществ в межволоконном взаимодействии. (Лигнин.) Благодаря высокой прочности МДФ значительно лучше, чем ДСП удерживает мебельную фурнитуру.

Благодаря качеству обработки, шлифовки и жёсткому контролю качества на всех этапах производство обеспечивается качество поверхности МДФ, что является важным показателем при производстве мебели. Благодаря своей высокой влагостойкости МДФ используется при производстве кухонной мебели и мебели для ванных комнат. Под воздействием пара мебель из МДФ не коробится.
Одним из самых важнейших и отличительных преимуществ МДФ является высокая технологичность этого материала. Поверхность МДФ легка в обработке, позволяет делать красивую филёнку, закруглённые углы и т.д. Деталям МДФ можно придать самую разнообразную форму, что значительно расширяет возможности производителей мебели при конструировании и разработке дизайна мебели.

Кроме того, стоит упомянуть такой немаловажный факт, что в производстве стеновых панелей на основе МДФ (MDF) не используются вредные для здоровья эпоксидные смолы и фенол. А значит, стеновые панели на основе МДФ (MDF) можно использовать в местах с повышенными требованиями к гигиене, например, в комплектах детской и кухонной мебели.

Как расшифровывается мдф панели — MOREREMONTA

В последние годы появилось много новых строительных и облицовочных материалов, но их названия, к сожалению, не всегда понятны. Например, на смену традиционным древесно-стружечным плитам пришли более качественные листы МДФ, расшифровка аббревиатуры которых не связана с русским языком. Начальные буквы относятся к наименованию материала на английском языке, поэтому правильным написанием считается MDF, а МДФ – это просто транскрипция иноязычного звучания, хотя существует вариант расшифровки аббревиатуры и в русском изложении.

Что такое плита МДФ

Листы изготавливаются в заводских условиях из сухой древесной стружки, имеющей мелкую дисперсию, и связующего в виде карбомидных смол. Низкое содержание формальдегида в плитах МДФ обеспечивается путем модифицирования смол меламином. Технология производства предусматривает сухой метод прессования при наличии двух требований – поддержания высокой температуры и необходимого давления. В дальнейшем плиты шлифуют, за счет чего получаются ровные и гладкие поверхности.

Готовые листы МДФ отличаются:

• высокой прочностью и плотностью;
• экологичностью, чего не скажешь о древесно-стружечных плитах;
• отличной влагостойкостью;
• отсутствием гниения и плесени;
• невозможностью развития микроорганизмов;
• однородной структурой;
• гигиеничностью;
• универсальностью;
• легкостью механической обработки;
• простым монтажом.

МДФ плиты выпускают ламинированными – с матовой или глянцевой поверхностью, шпонированными и под покраску. Они обеспечивают хорошую звукоизоляцию и внешне выглядят достаточно привлекательно, а листы с повышенной влагостойкостью близки по свойствам к пластику.

Как разобраться в аббревиатуре

Итак, плиты МДФ – что это такое, расшифровка каких слов заключается в сокращенном названии материала и как понимать эти три буквы? Под данной аббревиатурой в русском варианте предлагается понимать не что иное, как «мелко-дисперсионную фракцию». Но на самом деле, это является всего лишь одним из компонентов готовой плиты, а именно – древесной стружки мелкой дисперсии, используемой в производстве.

Английское название материала дает несколько другое понятие, а именно:

• Medium – средний;
• Density – плотность;
• Fibreboard – волокнистая плита.

Другими словами, MDF является «волокнистой плитой средней плотности». Можно только добавить – древесноволокнистой. Какая расшифровка больше нравится, такой и следует пользоваться. Но не сто́ит забывать о том, что производство плит в промышленном масштабе началось в США еще в 1966 году, поэтому пальму первенства следовало бы отдать английскому названию. В России материал начали выпускать лишь через 31 год, в 1997-м.

Сегодня мировым лидером по изготовлениюMDF-плит считается Китай.

Область применения

Универсальность МДФ обеспечивает широкую сферу использования плит. Их применяют при изготовлении мебели и межкомнатных дверей, напольных покрытий, карнизов и наличников. МДФ устанавливают в качестве перегородок и используют в отделочных работах. Из плит делают акустические колонки, упаковочные коробки и эксклюзивные предметы дизайна.

Экологичность материала позволяет применять МДФ в детских комнатах и дошкольных учреждениях. А привлекательный внешний вид дает возможность отделки декоративными панелями представительских кабинетов и офисов. MDF обладает лучшим качеством и имеет более высокие эксплуатационные характеристики по сравнению с самыми близкими аналогами – плитами ДСП и ДВП. Данный фактор отражается на многофункциональности и популярности рассматриваемого материала.

На сегодняшний день плиты МДФ получили широчайшее распространение. Из этого материала производят мебель, двери для комнат, электротехнические плинтуса и многое другое.

Что такое МДФ?

Аббревиатура МДФ произошла от сокращения англоязычного названия материала — Medium Density Fiberboard. Если перевести эту фразу на русский язык, то получится что МДФ — это плита из волокон древесины со средней плотностью.

В процессе изготовления МДФ используются стружки дерева, которые обрабатываются специальными связывающими веществами. Под воздействием давления и температур происходит спрессовывание волокон дерева, что позволяет получить плиту с высокими эксплуатационными свойствами.

Подобная технология использовалась для изготовления ДВП (древесноволокнистой плиты). Её усовершенствовали, благодаря чему стало возможным получить более прочный материал. По своей сути МДФ и ДВП это практически один и тот же материал, изготовленный по различным технологиям.

Сферы применения МДФ

Плиты из прессованных стружек стали довольно популярным материалом во многих сферах. В первую очередь благодаря своей низкой стоимости. Этот материал значительно легче дерева, что позволяет расширить области традиционного применения пиломатериалов.

Чаще всего изделия из МДФ можно встретить:

• в мебельной промышленности. Современные технологии позволяют сделать древесные плиты внешне очень схожими с натуральным деревом. Мебель, изготовленная из этого материала, выглядит очень эффектно, при этом значительно дешевле той, что изготовлена из массива дерева;
• в строительной отрасли. МДФ часто используют при производстве напольных покрытий (ламината), для изготовления и отделки дверей, а также в качестве стеновых панелей и многого другого;
• в электротехнической промышленности. Например, большинство акустических систем изготавливают из плит МДФ;
• дизайнеры интерьеров очень часто в своей работе используют этот материал для создания эксклюзивных предметов.

Широкое использование МДФ в производстве детской мебели обеспечивает её экологичность. При изготовлении стружечных плит не используются вещества, содержащие фенол. Смолы, служащие для связки волокон, идентичны натуральным смолам дерева.

Советы в статье «Как сделать фонтан на даче» здесь.

МДФ или ДСП что лучше? Преимущества и недостатки смотрим в видео:

Как расшифровывается МДФ

Наверное, каждый производитель мебели знаком с материалом МДФ и использует его для тех или иных целей. Но не каждый знает, как расшифровывается аббревиатура МДФ, что входит в состав МДФ плиты и какими свойствами она обладает.

Случаются и такое, что кто-то вовсе не знаком с данным материалом, хотя его название очень часто встречается и постоянно висит на слуху. Поэтому, впоследствии возникает закономерный вопрос – что такое МДФ и почему он имеет такую популярность?

Аббревиатура МДФ представляет собой транслитерацию английского названия Medium Density Fiberboard , в сокращении – MDF , что в дословном переводе обозначает «среднеплотная древесноволокнистая плита».

Из чего состоит МДФ

МДФ плита изготавливается из просушенных волокон древесины, обработанных связующими синтетическими веществами, которые формируются в форме прямоугольного утолщенного ковра для дальнейшего горячего прессования и шлифовки. Технология изготовления МДФ является усовершенствованным способом изготовления ДВП, в котором использовался метод сухого прессования сильно измельченной древесной стружки под высоким давлением и температурой.

В основе связующих веществ волокнистой структуры МДФ плиты используются модифицированные меламином карбидные смолы. При этом эмиссия формальдегида в МДФ остается на низком уровне, сравнимом с натуральным деревом. Таким образом, минимизировано выделение опасных для здоровья веществ.

Технологические свойства МДФ

Отвечая на вопрос, что такое МДФ, стоит рассказать о его физических свойствах и особенностях его применения в различных отраслях современной промышленности и строительстве.

Во-первых, МДФ плита обладает высокой механической прочностью. Благодаря этому качеству, материал получил широкое распространение в строительстве и, особенно, в мебельном производстве, так как не только превосходит другие материалы по устойчивости к механическому воздействию, но и отлично удерживает мебельную фурнитуру и крепеж.

Во-вторых, МДФ плита является прямым конкурентом ДСП по устойчивости к влаге и горячему пару.

В-третьих, благодаря мелкодисперсному составу, МДФ идеально подходит для механической обработки пильным, фрезеровальным и шлифовальным инструментом, что позволяет получать сложные фигурные изделия с наименьшими затратами труда.

И, в-четвертых, благодаря влагоотталкивающим свойствам, МДФ плита обладает устойчивостью к различным микроорганизмам и плесневым грибкам, что делает изделия экологически безопасными при использовании в быту.

Область применения МДФ

Благодаря своим технологическим свойствам плита МДФ получила свое распространение, в первую очередь, в мебельном производстве, особенно когда требуется изготовить фасады с элементами резьбы. Дальнейшая опрессовка МДФ фасадов в пленку ПВХ дает эффект сравнимый только с изготовлением мебели из натурального дерева. Следует отметить разнообразие различных элементов декора мебели выполненных из МДФ, таких как карнизы, рамочный профиль, декоративные панели МДФ и прочие изделия.

На втором месте по популярности использования материала МДФ, стоит ламинированное напольное покрытие. Здесь наиболее сильно проявились такие качества МДФ как прочность и влагоустойчивость. Кроме того, в строительной отрасли МДФ применяют в виде стеновых панелей, декоративных накладок на межкомнатные двери, для отделки наличников.

МДФ плита также используется в электронике, при производстве акустических систем, а также в качестве упаковки, в том числе с элементами декоративного орнамента.

Что такое МДФ? Ответ очевиден. Там где нет возможности использовать натуральное дерево или ДСП, как альтернативный материал чаще всего используется «древесная плита средней плотности».

Что означает МДФ?

24

Media Descript

000

Business» Продукты

0007 Устройство памяти

Вычислительная техника »Аппаратное обеспечение

MDF

МДФ и его применение Себастьян Друде и Ирина Невская Goethe-Universität Франкфурт RELISHME / LEXICON

Презентация на тему: «МДФ и его применение Себастьян Друде и Ирина Невская Goethe-Universität Frankfurt RELISH / Lexicon Meeting, Неймеген, июль 2010.»- стенограмма презентации:

ins [data-ad-slot = «4502451947»] {display: none! important;}}
@media (max-width: 800px) {# place_14> ins: not ([data-ad-slot = «4502451947»]) {display: none! important;}}
@media (max-width: 800px) {# place_14 {width: 250px;}}
@media (max-width: 500 пикселей) {# place_14 {width: 120px;}}
]]>

1

МДФ и его применение Себастьян Друде и Ирина Невская Goethe-Universität Frankfurt RELISH / Lexicon Meeting, Неймеген, июль 2010 г.

2

Приложения MDF и ist 1.МДФ: что это? 2.Организация MDF-формата 3.Преимущества, проблемы с MDF 4.Приложения и преобразования 5.MDF в проекте RELISH: Уди

3

Приложения MDF и ist 1.MDF: что это такое? 2.Организация MDF-формата 3.Преимущества, проблемы с MDF 4.Приложения и преобразования 5.MDF в проекте RELISH: Уди

4

1.МДФ: что это? Первоначально Multiple Dictionary Formatter был независимой компьютерной программой.Он преобразовывал определенные файлы в стандартном формате в RTF (для дальнейшей обработки и печати с помощью офисного программного обеспечения). Сегодня он является частью программы Toolbox (ранее Shoebox) в виде таблиц согласованных изменений. (* .cct, сложные сценарии для подпрограмм поиска и замены) и файлы шаблонов MS-Word (* .dot)

5

6

1.МДФ: что это? Стандартный формат (SF) — это очень старый текстовый формат, разработанный SIL с минимальной разметкой: содержимое организовано в «поля». Каждое поле состоит из «маркера» (новая строка, за которой следует обратная косая черта и последовательность букв, дефисов). , цифры и т. д.) и «содержимое поля» (свободный текст), отделенные от маркера пробелом. Это простая структура «функция – значение»

7

Поле ввода Маркер поля Содержание поля Файл данных «Стандартный формат»

8

1.МДФ: что это? Программа MDF использует определенный НАБОР маркеров, представляющих типичные категории данных, используемые в традиционной лексикографии. Свойства полей (язык и т. Д.) И минимальная иерархическая структура через связь «находится ниже» хранятся в отдельном «.typ» (тип) файл, который также находится в SF. В этом смысле файл в формате MDF является (SF) текстовым файлом, который использует набор маркеров MDF (в иерархической организации MDF)

9

Маркер деф.Описание Язык Позиция в иерархии MDF.typ (файл конфигурации)

10

Приложения MDF и ist 1.MDF: что это такое? 2.Организация MDF-формата 3.Преимущества, проблемы с MDF 4.Приложения и преобразования 5.MDF в проекте RELISH: Уди

11

2. Организация формата MDF. В настоящее время MDF поддерживает около 100 маркеров («MDF-поля»). Базовая иерархия: \ lx (лексема) └˃ \ se (подзапись) └˃ \ ps (часть речи) └˃ \ sn (смысловое число) Другие иерархии могут или использовались для поддержки: (\ lx> \ se> \ sn> \ ps или \ lx> \ sn> \ ps> \ se)

12

1.МДФ: что это? MDF задокументирован в книге: Coward, David F. & Grimes, Charles E. (2000). Создание словарей: руководство по лексикографии и Multi-Dictionary Formatter. Ваксхоу, Северная Каролина: SIL International (1-е изд. 1995 г.) URL: http://www.sil.org/computing/shoebox/MDF_2000.pdf http://www.sil.org/computing/shoebox/MDF_Updates.html http://www.sil.org/computing/shoebox/MDF_2000.pdf http://www.sil.org/computing/shoebox/MDF_Updates.html

13

14

2.Организация формата MDF Несколько полей могут повторяться для четырех разных языков, где «..» → v = местный, e = английский, n = национальный, r = региональный \ ps, \ pn — часть речи для основного слово входа (английское, национальное) \ g .. — глосс для основного слова статьи \ d .. — определение основного слова статьи \ re, \ rn, \ rr — обратное (для индексов) \ we, \ wn, \ wr — глянец на уровне слов \ x .. — пример (предложение и переводы) \ e .. — энциклопедическая информация \ u .. — информация об использовании \ o .. — только (ограничение) информация (\ va), \ ve, \ vn, \ vr — вариант комментария формы (\ cf), \ ce, \ cn, \ cr — глосс перекрестной ссылки (\ lf), \ le, \ ln, \ lr — «лексическая функция» (глосс для родственного слова) \ pd.. — «парадигма» (глосс для неправильной формы)

15

2. Организация MDF-формата. Не рекомендуется использовать около 20 полей: \ an (антоним), \ sy (синоним) следует заменить на \ lf (лексическая функция), \ lfv (лексическая функция разговорного языка), \ lf .. (лексическая функция глянец) поля \ sg (единственное число), \ pl (множественное число), \ 1s (первое лицо единственного числа) и т. д. должны быть заменены на \ pdl (метка формы парадигмы), \ pdv (форма парадигмы на местном языке), \ pd.. (глосс формы парадигмы) поля (еще не включены в документацию) Два поля (\ dt, \ st) являются административными полями Таким образом, существует только около 50 действительно разных полей MDF

16

2. Организация MDF-формата. Некоторые поля образуют блоки / группы посредством иерархии, например: \ lf (лексическая функция, отношения к другим статьям) └˃ \ lfv родственная форма, \ lf .. глосс отн. form (англ., nat., reg.) \ pd (Информация о парадигмах и неправильные формы) └˃ \ pdl pdg.метка, \ pdv pdg. форма, \ pd .. pdg. gl. (Англ., Нат., Рег.) \ Rf (ссылка на пример) └˃ \ xv пример формы на просторечии └˃ \ x .. перевод отн. form (англ., nat., reg.) \ cf (форма перекрестной ссылки) └˃ \ c .. перекрестная ссылка глосс (англ., nat., reg.) \ va (вариант формы) └˃ \ v. . комментарий к варианту формы (англ., нат., рег.)

17

Приложения MDF и ist 1.MDF: что это такое? 2.Организация МДФ-формата 3.Достоинства, проблемы с МДФ 4. Приложения и переделки 5. МДФ в проекте RELISH: Уди

18

3. Преимущества, проблемы с MDF. Преимущества: очень гибкий формат базы данных SF (необязательные поля, повторяющиеся поля и т. Д.). Достаточно исчерпывающий для стандартной лексикографии в полевых исследованиях языков меньшинств. Является стандартом де-факто, хотя Toolbox официально не поддерживается SIL. подробнее (теперь заменено на FIELD / FLEX)

19

3.Преимущества, проблемы с MDF Общие проблемы: Гибкость SF допускает несоответствия Только рекомендуемый порядок для родственных полей Почти всегда расширяется и настраивается произвольно отдельными пользователями (форматы на основе MDF / на основе MDF) Изменения в иерархии в конфигурации не отражаются в файл данных и наоборот Отсутствие закрывающих тегов в SF ухудшает преобразование

20

3. Преимущества, проблемы с MDF. Конкретные проблемы в проекте RELISH: \ ph (фонетическая форма) слишком общий, он может понадобиться в нескольких разных контекстах (\ cf, \ va, \ pdv, \ lfv…) \ lt (literal смысл) существует только для заглавного слова, он понадобится для заимствованных слов и т. д.Даже трех языков недостаточно. Установка свойства «язык» должна быть возможна для произвольных полей.

21 год

3. Преимущества, проблемы с MDF. Конкретные проблемы в проекте RELISH: Нет четкого решения для охвата нескольких диалектов. В частности, если ни один диалект не является «стандартным». Различные решения: — \ ue (информация об использовании) — \ oe (только / ограничение) — \ ns (заметки по социолингвистике, разновидности) — \ lf SynD =… (лексическая функция «Диалектный синоним») — \ va & \ ve (вариантная форма и английский комментарий) Большинство этих решений применимо только к заглавному слову, нам понадобится диалект маркировка \ lx, \ xv, \ va,…

22

3.Преимущества, проблемы с MDF Комментарий к проблеме диалекта в книге MDF: «Мы планируем, что в будущих улучшениях MDF будут поля, предназначенные для диалектной информации, но в настоящее время ограничения программирования не позволяют нам больше связывать поля. В настоящее время используйте \ va и \ lf SynD =. (сноска стр. 23)

23

Приложения MDF и ist 1.MDF: что это такое? 2.Организация MDF-формата 3.Преимущества, проблемы с MDF 4.Приложения и преобразования 5.MDF в проекте RELISH: Уди

24

4. Приложения и преобразования «Приложения» (формата) могут иметь разное значение: Для разных языков / проектов словарей. Для преобразований / преобразований: — печатные словари (через Toolbox, MDF, Word / RTF) — HTML (Lexique Pro) — XML (экспорт Toolbox) — LMF — XML ​​(импорт Lexus) — база данных FLEX

25

4.Приложения и преобразования Проблемы со всеми преобразованиями: что происходит с несоответствиями? Что происходит с разным порядком полей одного уровня? Что происходит с дополнительными полями (не из MDF)? Что происходит с вложенными записями?

26

4. Приложения и преобразования

27

28 год

29

30

Приложения MDF и ist 1.МДФ: что это? 2.Организация MDF-формата 3.Преимущества, проблемы с MDF 4.Приложения и преобразования 5.MDF в проекте RELISH: Уди

31 год

32

33

Цифровое представление печатного словаря с дополнениями Основная проблема: несколько языков: — удин (v) — азербайджанский (кириллица) (n1) — азербайджанский (латиница) (n1lat) (дополнение) — грузинский (n2) — русский (r) — Английский (e) (добавление)

34

5.MDF в проекте RELISH: Udi База данных Udi Toolbox использует 53 поля из них, 14 — стандартные поля MDF, 11 — поля MDF, которые имеют немного другое положение в иерархии. 28 полей — дополнительные поля — большинство (19) из них предназначены для настройки дополнительные «языки» (и скрипты) — 5 для дополнительных фонетических представлений

35 год

\ lx …. \ gn1. \ hm ….. \ dn1. \ se ….. \ ltn1. \ mn ….. \ nan1.. \ mn-ph ….. \ gn1lat .. \ ph …… \ dn1lat .. \ a …… \ ltn1lat … \ a-ph …… \ nan1lat .. \ bw …. \ gr .. \ ns ….. \ dr .. \ ng ….. \ ltr .. \ va ….. \ nar … \ va- ph …. \ gn2 … \ va-ns ….. \ dn2 .. \ pl ….. \ ltn2 … \ pl-ph ….. \ nan2 .. \ ee …. \ ge … \ er ….. \ de .. \ lt ….. \ oe … \ lte …. \ xv .. \ ps ….. \ xv-ph … \ pr ….. \ x-ns … \ sn ….. \ xn1 …. \ nt …… \ xn1lat …. \ gn1. …. \ xr ….. \ xn2 ….. \ xe. \ dt

36

Преобразование MDF-LEXUS 1. Из печатного словаря в текстовый файл разметки 2.От текстового файла разметки к структуре MDF в среде Toolbox 3. От структуры MDF к структуре LEXUS

37

Шаг 1. Из печатного словаря в текстовый файл разметки — 1

38

Шаг 1. От печатного словаря к текстовому файлу разметки — 2

39

Шаг 2.От текстового файла разметки до структуры MDF в среде Toolbox — 1 Установление корреляций различных комбинаций знаков и их лингвистических аналогов Установление структуры маркеров MDF и их иерархий Проверка согласованности: Ошибки перекрестных ссылок: — отсутствие заголовочного слова — отсутствие варианта Многочисленные орфографические ошибки Многочисленные ошибки русского и английского переводов Несоответствия в контрастных подстатьях и примерах

40

Шаг 2.Из текстового файла разметки в структуру MDF в среде Toolbox -2

41 год

Шаг 3. От конструкции МДФ к конструкции LEXUS — 1

42

Шаг 3. От конструкции МДФ к конструкции LEXUS — 2

43 год

Шаг 3.От конструкции МДФ к конструкции LEXUS — 3

44 год

Шаг 3. От конструкции МДФ к конструкции LEXUS — 4

45

5. МДФ в РЕЛИШЕ: Уди в Lexique Pro

46

47

48

49

50

От MDF к структуре FLEX Определение систем письма — Проблемы с введением орграфов и соответствующих порядков сортировки Определение свойств импорта — Проблемы с сопоставлением маркеров из-за разных маркеров и их иерархий — Ошибки импорта 2 попытки: — проект Udi1 — Project Udi 2

51

Попытка 1: проект Уди 1 (остаток импорта) — 1 Определение систем письма

52

Попытка 1: проект Udi 1 (остаток импорта) — 2 Определение формата файла

53

Попытка 1: проект Udi 1 (остаток импорта) — 3 Отображение языков

54

Попытка 1: проект Уди 1 (импортный остаток) — 4 Отображение содержимого

55

Попытка 1: проект Уди 1 (импортный остаток) — 5 Отображение содержимого

56

Попытка 1: проект Уди 1 (импортные остатки) — 6 ключевых маркеров

57 год

Попытка 1: проект Уди 1 (импортные остатки) — проверка готовности 7

58

Попытка 1: проект Уди 1 (импортные остатки) — 8

59

Попытка 1: проект Уди 1 (импортные остатки) — 9

60

Попытка 1: проект Уди 1 (импортные остатки) — 10

61

Попытка 2: проект Udi 2-1 системы кодирования записи

62

Попытка 2: проект Udi 2 — 2, определяющий формат файла

63

Попытка 2: проект Udi 2-3 языковое сопоставление

64

Попытка 2: отображение содержимого проекта Udi 2–4

65

Попытка 2: отображение содержимого проекта Udi 2–5

66

Попытка 2: проект Udi 2-6, определяющий настраиваемые поля

67

Попытка 2: проект Udi 2-7, модифицирующий отображение

68

Попытка 2: проект Уди 2-8 определение ключевых маркеров

69

Попытка 2: проверка готовности проекта Уди 2-9

70

Попытка 2: проект Udi 2-10 импорт результатов предварительного просмотра

71

Попытка 2: проект Udi 2-11 импорт результатов предварительного просмотра

72

Попытка 2: проект Уди 2-12 готов к импорту

73

Попытка 2: проект Udi 2 — 13 сбоев импорта

74

МДФ и его применение Себастьян Друде и Ирина Невская Goethe-Universität Frankfurt RELISH / Lexicon Meeting, Неймеген, июль 2010 г.

(PDF) RP-HPCL и профиль транскрипта указывают на повышенное содержание кофеина в листьях растений Coffea canephora на свету.

2

| Kumar et al. Воздействие света увеличивает содержание кофеина

Журнал биологии и наук о Земле, 2015; 5 (1): 1-9

свет соответственно [2]. Передача сигнала через фоторецепторы

зависит от белков, таких как GT-1 и

GATA, в качестве основных факторов транскрипции [3].

Кофе — уроженец африканского континента

, где дикие виды обитают в подножье

тропических лесов [4].Сегодня основная часть

мировой продукции выращивается в Бразилии (около

— одна треть от общего мирового производства) (www.ico.

org). Практика выращивания кофе

во всем мире меняется с использованием устойчивых к солнцу сортов, которые значительно улучшают урожайность [5]. Однако они

имеют серьезные недостатки, такие как вырубка лесов, ущерб биоразнообразию, большое количество пестицидов и

удобрений и ухудшение состояния почвы / воды [6].Индия

, которая является шестым по величине производителем кофе (311,52

тысяч тонн в 2013-2014 гг.), В основном

полагается на кофе, выращенный в традиционных оттенках, и является

одной из стран, где выращивают кофе в

наибольших количествах. экологические условия [7]. Более того, помимо марки

как премиальный кофе, культиваторы выращенного кофе оттенка

имеют преимущество скрытого дохода

в виде пересеянных плантаций, таких как

перец, кардамон, апельсин, банан и ваниль [8].

Shade, как известно, улучшает качество чашки

кофе за счет увеличения редуцирующих сахаров и

за счет увеличения содержания хлорогеновой кислоты во фруктах [9, 10].

По мере того, как споры о преимуществах теневого кофе

продолжаются, и с недавними отчетами, указывающими №

значительное снижение продуктивности некоторых теневых плантаций

выращиваемой арабики, ясно, что

преимущества теневых плантаций кофе

можно было бы расширить путем тщательного проектирования

тенистого полога и используемого генотипа плантаций

[11, 12].Таким образом, это возможность изучить влияние света

на биосинтез кофеина — основной молекулы

, вызывающей озабоченность в отношении потребления кофе более

[13].

Путь метаболизма кофеина является продолжением

метаболизма нуклеотидов посредством более широко обнаруженного соединения ксантозина. Биохимический путь

хорошо охарактеризован, и гены

(N-метилтрансферазы), участвующие в биосинтезе

, были клонированы и секвенированы из кофе, чая,

какао и гуараны, где это происходит спорадически

через конвергентную эволюция [14, 15].Ксантозин

последовательно метилирован по позициям N

7

, N

3

и N

1

пуринового кольца, образуя 7-метил-

ксантозин, теобромин и, наконец,

[ рассмотрено 16]. Гены N-метилтрансферазы

характеризуются как ксантозинметилтрансфераза

(XMTs), 7-метилксантинметилтрансфераза или

теоброминсинтаза (MXMT) и 7,3-диметил-

ксантинкафета 70007 ксантин-метилтрансфераза 9000XM000).Исследования NMT C. arabica показывают, что

— два варианта теоброминсинтазы,

, один кодирует 378 аминокислот (CaMXMT1, CTS1),

, а другой — 384 аминокислоты (CaMXMT2,

CTS2) [обзор 17]. После завершения последовательности генома кофе

было показано, что

эволюция биосинтеза кофеина в кофе на

отличается от таковой в чае и какао, и

происходили быстрее в кофейной линии из-за

. семейство генов NMT с высокой степенью дупликации, включающее

девятнадцати генов-членов C.canephora [18]. Промотор

гена теоброминсинтазы (кислотный вариант 378 амино

) из Coffea canephora указывает

на присутствие многочисленных светочувствительных мотивов

, таких как бокс GT-1 и бокс GATA, большинство из которых, по-видимому, расположены в кластерах и причастны к роли

света в регуляции биосинтеза кофеина [19].

Более ранние результаты эксплантатов культур тканей также указывают на повышенное накопление кофеина в ответ на свет

[20].Однако влияние света на накопление кофеина

точно не изучалось на уровне всего растения / проростка. Таким образом, данное исследование предлагается

для изучения влияния света и

условий полной темноты на накопление кофеина

в Coffea canephora var. робуста cv. S 274, оба

на биохимическом и молекулярном уровнях, в молодых

листьях проростков в контролируемых лабораторных условиях.S 274 был разработан в Исследовательском институте Central Coffee

, Индия, путем массового отбора,

как один из немногих выпущенных сортов робусты в стране

. Новые сеянцы выращивают из

семян

маточных плантаций [21].

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Растительные материалы и методы обработки

Однолетние C. canephora var. robusta

S274 саженцы, содержащиеся в почвенных горшках в зеленом цвете

дом с полным куполом и 30 секунд: 30 секунд сприн-

kler орошение замачивали в воде и промывали в медленной проточной воде

, чтобы удалить приставшую к

почву. корни с минимальным повреждением растений.Саженцы

были акклиматизированы к 400 мл жидкой питательной среды 1x Hoagland

в течение трех дней в теплице и

, а затем подверглись полной темноте в течение

. Объяснение, что в вашем расшифровке стенограммы | Сертификаты и поверки

Оценки (100-балльная шкала)

70-100 — работа стандарта 1 класса

60-69 — работа стандарта Класса 2.1

50-59 — работа 2 класса.2. стандарт

45-49 — работа 3 класса

40-44 — работа Пропуска стандарт

0-39 — не удалось *

* Если вы начинаете уровень 3 или 4 и взяли модуль / модуль на уровне 7 FHEQ, любой уровень от 0 до 49 считается неуспешным.

Лекарственные сорта (МБЧБ)

3-5 = Пройдено

1 = Ошибка

0 = Работа не отправлена ​​

Стоматологические классы

50-100 = пройти

0-49 = Ошибка *

* До 2009-10 гг. Оценка 0 определялась как «Работа не отправлена».

Для курсов MBChB и бакалавриата по стоматологии, оценка D рядом с оценкой или результатом модуля указывает на различие. То же самое и с любыми модулями «Достичь большего», которые работали с 2014 по 2017 год.

Коды результатов модуля / блока

P (Успешно) : вам присвоен общий проходной балл.

F (Неудачно) : вам присвоена общая числовая оценка неуспешно.

DE (отложенный результат) : ваш результат для модуля / модуля был задержан, но ожидается, что он будет доступен в ближайшее время.

EX (Exempt) : вы официально освобождены от модуля / модуля в связи с предыдущим обучением или опытом работы.

MD (Модуль отброшен) : Если вам разрешили удалить модуль / модуль после периода добавления / удаления (третья неделя семестра), этот модуль все равно будет отображаться в вашей записи как MD.

NA (оценка не проводилась) :

• вы не пытались сдать экзамен / экзамен по договоренности с вашим отделом; или
• ваш отдел запросил, чтобы вы были записаны как NA по уважительным причинам (например,г. медицинский)

NC (не завершено)

• вы не сдавали работу / не сдавали экзамен без согласования с вашим отделом; или
• : представленная вами работа не считается академической; или
• факультет или университетский дисциплинарный комитет решили применить соответствующие Общие правила, чтобы отказать вам в зачете модуля / модуля или отказать в нем.

Классификация степеней

1 — Отличие 1 класса

2.1 — Класс 2, Дивизион 1, с отличием

2,2 — Класс 2 Раздел 2 С отличием

3 — Отличие 3 класса

H — Несекретные награды

P — Пройдено

AG — Aegrotat (объяснение см. В разделе 14-15 Общих правил для первых степеней)

Отказ (окончательный) — Отказ

WH (финал) — результаты не разглашаются

DE (Final) — Отсроченный результат

NA (окончательный) — не начислялся

Звездочка (*) напротив единицы в вашем онлайн-отчете о результатах UG означает, что эта единица не является зачетной и не повлияет на вашу способность переходить на следующий уровень обучения или на получение окончательной степени.

Для получения информации о том, как мы рассчитываем вашу окончательную степень, посетите страницу ниже.

Модули / единицы последипломного образования имеют проходной балл 50 или выше. Рядом с каждым модулем в вашей расшифровке вы получите один из следующих кодов:

P (Успешно): вам присвоен общий проходной балл.

AG (Aegrotat) : объяснение см. В разделе 11-12 Общего регламента о высших степенях, дипломах о послевузовском и последипломном образовании.

F (Неудачно): вам присвоена общая числовая оценка неуспешно.

DE (отложенный результат): ваш результат модуля / модуля был задержан, но ожидается, что он будет доступен в ближайшее время.

EX (Освобождение): вы официально освобождены от модуля / модуля в связи с предыдущим обучением или опытом работы.

MD (Модуль удален): Если вам разрешили удалить модуль / модуль после периода добавления / удаления (третья неделя семестра), этот модуль все равно будет отображаться в вашей записи как MD.

NA (не оценивался):

• вы не пытались сдать экзамен / экзамен по договоренности с вашим отделом; или
• ваш отдел запросил, чтобы вас записали как NA по уважительным причинам (например, по медицинским причинам).

NC (не завершено):

• вы не сдавали работу / не сдавали экзамен без согласования с вашим отделом; или
• : представленная вами работа не считается академической; или
• факультет или университетский дисциплинарный комитет решили применить соответствующие Общие правила, чтобы отказать вам в зачете модуля / модуля или отказать в нем.

Не сдал (окончательный) или не сдал (окончательный): вы не сдали выпускные экзамены по вашей программе обучения. Посетите страницу ниже, чтобы узнать, что делать дальше.

Отсроченный результат (окончательный): результаты для одного или нескольких ваших подразделений или ваша рекомендация по награде еще не доступны. Ваша стенограмма будет переиздана, когда мы получим все ваши результаты.

WD Fail (Осталось после неудачного завершения): вы исчерпали все возможные возможности для сдачи экзамена по вашей программе обучения, и ваша регистрация будет прекращена.

Как устроен ваш курс

Ваша программа имеет модульную структуру. Каждой единице / модулю обучения в рамках вашей программы присваивается код единицы и зачетная стоимость.

Если вы учитесь у нас в течение полного учебного года по программе бакалавриата, вы изучаете единицы / модули на сумму 120 кредитов в каждом учебном году. Если вы учитесь в аспирантуре, вы изучаете единицы / модули на сумму 180 кредитов.

Для каждого блока / модуля записывается один общий результат.Ваш домашний университет может преобразовать это в оценку по своей шкале оценок.

Европейская система перевода кредитов (ECTS)

В таблице ниже представлена ​​шкала оценок, которую мы используем для ваших единиц / модулей, а также ее эквивалент в Европейской системе перевода зачетных единиц (ECTS).

2 британских кредита = 1 кредит ECTS

Те же оценки используются для единиц аспирантуры, но 50 и выше по шкале ниже считается пройденным.

Для блоков на уровне 7 FHEQ, сдаваемых учащимися, начинающими уровень 3 или 4 в сентябре 2014 г. или позже, любая оценка от 0 до 49 определяется как «Неудачно».

Коды результатов модуля / блока

Рядом с каждым модулем в расшифровке стенограммы вам будет присвоен один из следующих кодов:

P (Успешно) : вам присвоен общий проходной балл.

F (Неудачно) : вам присвоена общая числовая оценка неуспешно.

DE (отложенный результат) : ваш результат для модуля / модуля был задержан, но ожидается, что он будет доступен в ближайшее время.

EX (Exempt) : вы официально освобождены от модуля / модуля в связи с предыдущим обучением или опытом работы.

MD (Модуль отброшен) : Если вам разрешили удалить модуль / модуль после периода добавления / удаления (третья неделя семестра), этот модуль все равно будет отображаться в вашей записи как MD.

NA (оценка не проводилась) :

• вы не пытались сдать экзамен / экзамен по договоренности с вашим отделом; или
• ваш отдел запросил, чтобы вас записали как NA по уважительным причинам (например, по медицинским причинам).

NC (не завершено) :

• вы не сдавали работу / не сдавали экзамен без согласования с вашим отделом; или
• : представленная вами работа не считается академической; или
• факультет или университетский дисциплинарный комитет решили применить соответствующие Общие правила, чтобы отказать вам в зачете модуля / модуля или отказать в нем.

Оценки для единиц последипломного образования (где числовая часть кода единицы начинается с шести, например, MAS6100) обычно не доступны до ноября после того, как вы завершили модуль / модуль.

В период с 1994 по 2000 год мы использовали 16-балльную шкалу, указанную ниже, для оценки ваших модулей.

Единица оценки (16-балльная шкала)

Бакалавриат

14-16 — Работа стандарта 1 класса

11-13 — Работа класса 2.1 стандарт

8-10 — Работа стандарта класса 2.2

5-7 — Работа стандарта 3 класса

4 — Работа пропуска стандарт

1-3 — Отказ

0 — Работа не сдана

Аспирантура и Школа клинической стоматологии UG

8-16 — Пройдено

1-7 — Отказ

0 — Работа не сдана

Структура квалификаций высшего образования (FHEQ)

FHEQ — это согласованная на национальном уровне система определения квалификаций высшего образования в Англии, Уэльсе и Северной Ирландии.

Основное назначение:

• помогает определить потенциальные пути развития
• служат отправной точкой для установления и оценки академических стандартов
• способствует общему пониманию ожиданий, связанных с типовой квалификацией

Он также разработан в соответствии с квалификационными рамками Европейской арены высшего образования (FQ-EHEA).

FHEQ имеет в общей сложности восемь уровней, при этом квалификация бакалавриата начинается с уровня 4.

• Уровни 1-3: предварительное обучение в бакалавриате
• Уровень 4: первая часть бакалавриата
• Уровень 5: средняя часть бакалавриата
• Уровень 6: последняя часть бакалавриата
• Уровень 7: степень магистра
• Уровень 8: Докторантура

Степени бакалавра с отличием обычно состоят из 360 кредитов и минимум 90 кредитов на уровне 6 FHEQ.

Интегрированные степени магистра обычно состоят из 480 кредитов, минимум 120 кредитов на уровне 7 FHEQ.

Уровень структуры квалификаций (уровень QF)

Уровни

QF относятся к общему уровню, на котором вы должны работать в конкретном учебном году.

• например Ваш первый год обучения в бакалавриате будет на уровне 4 QF, второй — на уровне 5, а третий — на уровне 6.

Уровни FHEQ модулей, которые вы изучаете в течение года, могут различаться, причем некоторые из них могут быть выше или ниже общего уровня QF вашего курса в этом году.

• например , если вы учитесь на втором курсе бакалавриата и изучаете языковой модуль для новичков на уровне 4 FHEQ, ваш уровень QF все равно будет 5-го уровня.

Рамки квалификаций европейской арены высшего образования (FQ-EHEA)

FQ-EHEA объединяет национальные квалификации высшего образования по всей Европе в общеевропейскую структуру, чтобы определить их относительные уровни сложности и сложности.

В FQ-EHEA три уровня высшего образования определены как «циклы».

Первый цикл: в целом соответствует квалификациям бакалавриата в Великобритании (FHEQ Level 6).

Второй цикл: в целом соответствует последипломной квалификации, обычно на уровне магистра в Великобритании (FHEQ Level 7).

Третий цикл: в целом соответствует квалификациям аспирантуры, как правило, докторантуры в Великобритании (уровень 8 FHEQ).

Европейская система перевода и накопления кредитов (ECTS)

ECTS была разработана для содействия международному признанию квалификаций и мобильности студентов в Европе.

2 британских кредита эквивалентны 1 баллу ECTS.

По вопросам об окончании школы:

По вопросам о ваших индивидуальных оценках:

Для общих вопросов о том, что будет дальше:

Для иммиграционной консультации:

гены контрольной точки сборки веретена обнаруживают как отличную, так и перекрывающуюся экспрессию, которая участвует MDF-2 / Mad2 в пролиферации клеток постэмбрионального шва у Caenorhabditis elegans | BMC Molecular and Cell Biology

Получение pSAC :: GFP

C.elegans и характеристика паттернов экспрессии SAC

Для изучения временной и пространственной экспрессии генов SAC мы создали транскрипционные репортерные трансгенные штаммы C. elegans для пяти широко консервативных основных компонентов контрольной точки ( mdf-1 / MAD1 , mdf-2 / MAD2 , san-1 / MAD3 , bub-1 / BUB1 и bub-3 / BUB3 ) и четыре компонента SAC, сохраненные только у высших эукариот ( hcp-1 / CENP -F , hcp-2 / CENP-F, czw-1 / ZW10 и rod-1 / ROD ) (Таблица 1).Все выбранные гены, за исключением mdf-1 , не входят в состав оперонов, и поэтому последовательности, расположенные непосредственно перед ним, были использованы для анализа их промотора. mdf-1 , с другой стороны, является частью оперона и был исследован с использованием трех различных конструкций промотора (таблица 1, дополнительный файл 1, рисунок S1). Слияния промотор :: GFP были созданы с использованием техники «сшивания ПЦР» [19], а не с помощью методов клонирования, чтобы избежать потенциального вмешательства со стороны клонирующих векторных скелетов на экспрессию трансгенов, как недавно сообщили Etchberger and Hobert, 2008 [20].Предполагаемые «промоторные» ампликоны были «сшиты с помощью ПЦР» с продуктами ПЦР, содержащими последовательность, кодирующую gfp (вариант S65C), которая включает искусственные интроны и unc-54 3’UTR из вектора pPD95.75 (разработанный Dr. Эндрю Файер, Институт Карнеги). 5 ‘области, исследованные в этом исследовании как предположительно содержащие регуляторы генов SAC, простирались от предполагаемого сайта инициатора ATG для гена-мишени до его соседнего вышестоящего гена. Длина вышележащих регионов, определяемая этими критериями, варьируется от 282 пар оснований до 3000 пар оснований (Таблица 1) и соответствует ранее описанным минимальным и максимальным длинам промоторов, используемых в крупномасштабных проектах [21-25].Всего было сконструировано 12 транскрипционных слияний с gfp, соответствующих девяти интересующим генам контрольной точки (Таблица 1). Для каждой конструкции мы сгенерировали по крайней мере три независимых строки, которые сравнивали на согласованность паттернов экспрессии. Из-за проблем мозаицизма, связанных с внехромосомными конкатамерными массивами, мы проанализировали по крайней мере 30 повторов и зарегистрировали GFP-экспрессирующие клетки и ткани, которые показали экспрессию по крайней мере у 50% животных на любой данной стадии развития, как описано ранее [23].

Таблица 1 Резюме постэмбриональной пространственной экспрессии GFP, наблюдаемой для транскрипционных репортеров гена SAC

Наш анализ регуляторной активности гена SAC показал, что все конструкции SAC, за исключением p czw-1 :: GFP, обеспечивают экспрессию GFP (таблица 1). Последовательность 2,101 п.н. перед czw-1 не приводила к какой-либо детектируемой экспрессии GFP на любой стадии развития ни в одной из четырех проанализированных независимых трансгенных линий. Мы также исследовали другую конструкцию, которая содержала последовательность 3 т.п.н. выше czw-1 и все еще не наблюдала никакой экспрессии (Таблица 1).Важно отметить, что наш анализ других восьми генов SAC выявил экспрессию, которая согласовывалась между независимыми линиями для каждой данной конструкции (таблица 1). Мы обнаружили GFP на всех стадиях развития, за исключением очень молодых эмбрионов (моложе 12 эмбрионов на клеточной стадии), и идентифицировали экспрессированный GFP во всех основных тканях, кроме зародышевой линии, вероятно, из-за сайленсинга зародышевой линии конкатамерных массивов [26]. .

Промоторы генов контрольных точек сборки веретена управляют сходной экспрессией в раннем эмбрионе и 2).Фактически, мы смогли обнаружить экспрессию GFP до того, как эмбрионы перешли к гаструляции (рис. 1А). Поскольку мы наблюдали мозаицизм из-за митотической потери массивов конкатамеров (рис. 1 и 2), мы проанализировали множество эмбрионов на конструкцию. Наши результаты показывают, что промоторы гена SAC управляют экспрессией GFP в большинстве ранних эмбриональных клеток (Рисунки 1A-D и 2). Единственная конструкция, которая не управляла повсеместной экспрессией GFP в ранних эмбрионах, — это предполагаемый промотор

mdf-1 , который находится в опероне, который простирается выше сайта инициатора ATG в первом гене, his-35 , из оперон соседнего вышестоящего гена ( his-41 ) (дополнительный файл 1, рисунок S1A).С другой стороны, оба транскрипционных слияния, которые включали внутренний промотор mdf-1 , выявили одинаковые повсеместные активности у ранних эмбрионов (дополнительный файл 1, рисунок S1B, C). Принимая во внимание установленную роль гена контрольной точки mdf-1 в наблюдении за переходом от метафазы к анафазе, а также наблюдаемую локализацию антител в делящихся клетках ранних эмбрионов [27], мы заключаем, что mdf-1 содержащий оперон принадлежит к классу «гибридных оперонов» [28], в котором внутренний промотор mdf-1 необходим для обеспечения правильной экспрессии этого гена в эмбриональных клетках.

Рисунок 1

Паттерны экспрессии, управляемые промотором mdf-2 . p mdf-2 :: GFP экспрессируется на всех стадиях развития C. elegans . Репрезентативные изображения пре-запятой (A-D), средней (E и F) и поздней (G и H) стадий эмбриона с большинством клеток, экспрессирующих GFP. (I-L) Типичные изображения сигнала GFP в шовных клетках в L3 (I и J) и клетках кишечника в L2 (K и L). (M-T) Типичные изображения взрослых тканей, которые содержат сигнал GFP, включая клетки шва (M и N), кишечника (O и P), глотки (Q и R) и вульвы (S и T).Масштабная линейка составляет 25 мкм.

Рисунок 2

Эмбриональная экспрессия семи генов контрольных точек сборки веретена . (A-G) Репрезентативные изображения ранних эмбриональных (стадия до запятой) активности промотора SAC; Показаны изображения GFP и DIC. (A) Для mdf-1 изображена 5′-регуляторная область размером 1332 п.н., которая содержит внутренний промотор. (F) Для промотора hcp-2 показан эмбрион на стадии фасоли. Обратите внимание, что на некоторых изображениях, таких как (E), наблюдается явный мозаицизм.Некоторые ядра имеют слабый сигнал GFP, а некоторые не обнаруживают сигнала. Вероятно, это связано с потерей массива. Масштабная линейка представляет 10 мкм.

Клеточные циклы ранних эмбриональных клеток в C. elegans быстрые, полностью состоят из S фазы и митоза и не имеют фаз пропусков [29]. Эта быстрая пролиферация эмбриональных клеток создает более половины соматических клеток C. elegans , причем большинство клеточных делений завершается в первой половине эмбриогенеза [30].Таким образом, совместная экспрессия генов SAC в быстро делящихся ранних эмбриональных клетках (Рисунки 1A-D и 2) согласуется с хорошо установленной ролью этих генов в делении клеток. Помимо активности промоторов гена SAC в ранних эмбрионах, мы также наблюдали экспрессию GFP в более поздних эмбрионах для всех промоторов веретено-checkpoint, которые мы проанализировали. Паттерны экспрессии в поздних эмбрионах показывают экспрессию GFP в большинстве клеток, хотя большинство промоторных конструкций имеют тенденцию обеспечивать более локализованную экспрессию GFP, как проиллюстрировано для mdf-2 (Рисунок 1G).В совокупности ожидаемые промоторные активности генов SAC во время эмбриогенеза показывают, что промоторы, используемые для нашего анализа, подходят.

Промоторы SAC управляют тканеспецифической экспрессией генов на более позднем этапе развития

Быстрая пролиферация клеток происходит на всех четырех личиночных стадиях, особенно на второй личиночной стадии (L2) развития у C. elegans , когда образуется много соматических клеток [30] . Как и ожидалось, экспрессия GFP, обеспечиваемая промоторами гена SAC, была обнаружена на всех четырех личиночных стадиях (таблица 1).В отличие от эмбриональной экспрессии, пространственно-временной анализ показал, что постэмбриональная экспрессия генов SAC обычно ограничена конкретными типами клеток и тканей (Таблица 1). Например, промотор mdf-2 управляет экспрессией GFP в клетках шва (Рисунок 1I), клетках кишечника (Рисунок 1K) и некоторых дополнительных типах тканей (Таблица 1) на всех личиночных стадиях. Напротив, промоторы mdf-1, , ^, и rod-1, специфически управляют экспрессией GFP в клетках кишечника после эмбриогенеза (Таблица 1).В отличие от промоторов mdf-2 , mdf-1 и rod-1 , промотор hcp-1 оказался активным в большинстве, но не во всех проанализированных тканях, включая дорсальный / вентральный нервный тяж, головку. / tail / body нейроны и многие другие типы тканей (таблица 1). Таким образом, постэмбриональный пространственный анализ выявил отчетливую, но частично перекрывающуюся тканеспецифичную экспрессию генов SAC во время личиночного развития.

Неожиданно мы также наблюдали тканеспецифическую экспрессию генов SAC на поздней личиночной (поздний L4) и взрослой стадии (Рисунки 1M-T и 3).Поскольку нет делений клеток во время позднего L4 и во взрослом возрасте, за исключением делений в соматических гонадах, которые приводят к развитию ооцитов [30], наши наблюдения подтверждают, что гены SAC экспрессируются в непролиферирующих клетках у C. elegans . Подобно профилям экспрессии личинок, тканеспецифическая экспрессия наблюдается и у взрослых животных. Например, как и у личинок, промотор mdf-2 управляет экспрессией GFP в клетках шва и гиподерме (рис. 1M), клетках кишечника (рис. 10), глотке (рис. 1Q) и вульве (рис. 1S).Паттерны экспрессии, обнаруженные во взрослых тканях, дополнительно подтверждают поразительную совместную экспрессию генов контрольных точек в клетках гиподермального шва (Фигуры 3H-L) и кишечнике (Фигуры 3A-G), которые мы наблюдали на личиночных стадиях.

Фигура 3

Коэкспрессия генов SAC в клетках кишечника и шва взрослых животных . (A-G) Все промоторы SAC управляют экспрессией GFP в клетках кишечника, обозначенных стрелками . (H-L) Большинство промоторов гена SAC управляют экспрессией GFP в шовных клетках, обозначенных стрелками .Масштабная линейка составляет 25 мкм.

Отсутствие MDF-2 приводит к аберрантному количеству и выравниванию ядер клеток шва

Мы были заинтересованы в том, чтобы проверить, будет ли отсутствующий или нефункциональный SAC вызывать аберрантное развитие клеток постэмбрионального шва. Для этого анализа мы выбрали mdf-2 . MDF-2 имеет 40% идентичность последовательности с почкующимися дрожжами Mad2 и спасает чувствительность к беномилу нокаутного штамма mad2 у дрожжей, указывая на сохранение функциональных контрольных точек [9].Подобно Δmdf-1 , отсутствие MDF-2 ведет к серьезным дефектам в развитии личиночных и зародышевых клеток, подтверждая важную роль в постэмбриональном развитии [9, 12]. В отличие от Δmdf-1 , нокаут-штамм mdf-2 является жизнеспособным [12].

Наш пространственно-временной анализ с использованием внехромосомных конкатамерных массивов показал, что промотор mdf-2 управляет экспрессией репортера GFP в клетках гиподермы и шва (Фигуры 1I и 1M), а также в некоторых других типах клеток.Мы также сконструировали два хромосомных интегрирующих штамма p mdf-2 :: GFP , стабильную линию с несколькими копиями (предположительно интегрированную в геном) и стабильную линию, полученную с использованием недавно разработанной Mos1-опосредованной вставки одной копии (MosSCI). метод [31]. Используя многокопийную стабильную линию, мы наблюдали аналогичные паттерны экспрессии в клетках гиподермы и шва (рис. 4A), а также в других типах клеток. С другой стороны, метод MosSCI позволяет интегрировать трансгены в виде отдельных копий в несколько конкретных локусов в C.elegans ‘геном. Хотя стабильная линия p mdf-2 :: GFP , созданная с использованием MosSCI, имела более чем в 10 раз более низкую интенсивность экспрессии GFP, чем стабильная линия с несколькими копиями (данные не показаны), она дополнительно подтвердила паттерны экспрессии, которые мы наблюдали с использованием ap mdf-2 :: GFP экстрахромосомный трансген в постэмбриональных клетках гиподермы и шва (данные не показаны).

Фигура 4

mdf-2/ MAD2 (ген веретено-контрольной точки) экспрессируется в клетках гиподермального шва и важен для их правильного развития .(A) Экспрессия, управляемая промотором mdf-2 в гиподерме ( длинная стрелка ) и клетках шва ( короткая стрелка ) с использованием мультикопийной стабильной линии JNC116. Масштабная линейка составляет 25 мкм. (B) Взрослый червь дикого типа, содержащий 16 ядер SCM :: GFP, происходящих из H0-h3, V1-V6 и из клетки Т-шва. (C) Количественный анализ 251 животного с дефектом клетки шва. Черные столбцы представляют процент дополнительных клеток, наблюдаемых в отдельных ячейках шва, а серые столбцы представляют процент отдельных ячеек шва, которые отсутствуют у дефектных животных.

Чтобы определить последствия отсутствия MDF-2 для нормального развития клеток шва, мы исследовали и количественно оценили количество ядер шовных клеток в трансгенных штаммах, экспрессирующих SCM :: GFP [32] ( s eam c ell m arker, слитый с GFP) в нокауте mdf-2 (tm2190 ), Δmdf-2 , фон с использованием флуоресцентной микроскопии (рисунки 4B, 5 и 6). Делеция tm2910 удаляет 864 нуклеотида между интроном 3 и экзоном 6 и, вероятно, является нулевой мутацией.Маркер SCM :: GFP позволяет визуализировать количество ядер клеток шва и их морфологию во время развития. Наш анализ молодых взрослых животных, гомозиготных по Δmdf-2 , выявил как качественные, так и количественные различия по сравнению с животными дикого типа (рисунки 4-6; таблица 2). В то время как взрослые гермафродиты дикого типа обычно содержат по 16 равномерно расположенных и выровненных ядер SCM :: GFP на каждой стороне животных [32] (рис. 4B), Δmdf-2 взрослых гермафродитов часто имеют не выровненные ядра шовных клеток, сгруппированные в одно. часть тела (рисунки 5 и 6).Такая кластеризация кажется стохастической (рис. 5), и каждый кластер может содержать два (рис. 5A, B), три (рис. 5C), четыре (рис. 5D) или даже больше ядер клеток шва (рис. 5E). Чаще некоторые клетки шва отсутствуют (рис. 4C), в результате чего у животных дикого типа наблюдается менее 16 ядер SCM :: GFP (рис. 4B). В совокупности в отсутствие MDF-2 количество ядер SCM :: GFP значительно снижается у молодых взрослых червей с 16 (наблюдаемых у животных дикого типа) до 14 у гомозигот Δmdf-2 (непарный t-тест, р = 2.96E-12) (Таблица 2). Кроме того, используя маркер апикального соединения ajm-1 :: GFP [33], мы наблюдали нарушения синцитий шва у взрослых гомозиготных червей Δmdf-2 (данные не показаны), что дополнительно подтверждает важность MDF-2 для правильного развитие клеток шва.

Рисунок 5

Репрезентативные изображения дополнительных SCM :: GFP-положительных ядер, наблюдаемых у животных mdf-2 (tm2190 ) . (A) У животного 17 положительных ядер SCM :: GFP.Похоже, что у него есть одна дополнительная ячейка шва V3, две слитые вместе. (B) У животного 17 положительных ядер SCM :: GFP. Кажется, у него есть одна дополнительная ячейка шва V6. (C) У животного 18 положительных ядер SCM :: GFP. Похоже, у него есть две дополнительные ячейки шва V6. (D) У животного 19 положительных ядер SCM :: GFP. Похоже, у него есть три дополнительных ячейки шва V3. (E) Пример пяти SCM :: GFP-положительных ядер в области, где должна находиться только одна шовная клетка. Изображенные животные относятся к категории L4 или молодых взрослых особей.

Рисунок 6

Репрезентативные изображения mdf-2 (tm2190 ) гомозигот только с 15 SCM :: GFP-положительными ядрами . (A) Кажется, что ячейка шва h2 отсутствует. (B) Пример неоднозначного случая, когда отсутствует ядро ​​шва V1 или V2. (C) Кажется, что ячейка шва V2 отсутствует. (D) Кажется, что ячейка шва V3 отсутствует. (E) Кажется, что ячейка шва V4 отсутствует. (F) Кажется, что ячейка шва V6 отсутствует. Стрелки изображают одно ядро ​​шва в линиях, где, как ожидается, будут наблюдаться два ядра шва.

Таблица 2 Среднее количество ядер SCM :: GFP изменено у мутантов mdf-2 (tm2190 )

Во время нормального развития 10 клеток шва-предшественника, H0-2, V1-6 и T, образуются во время эмбриогенеза. и присутствуют в L1 после вылупления. Во время L2 шесть из 10 предшественников подвергаются симметричному делению с образованием дополнительных ячеек шва, всего 16 ячеек шва в конце L2 и далее [34]. Следовательно, дефекты шовных клеток, наблюдаемые у молодых взрослых червей mdf-2 (tm2190 ), могут быть вызваны либо дефектными делениями эмбриональных клеток, либо, альтернативно, дефектными постэмбриональными делениями.Чтобы обратиться к этим двум возможностям, мы подсчитали количество ядер клеток шва у только что вылупившихся личинок дикого типа и Δmdf-2 L1 личинок. Анализируемые животные дикого типа имели среднее количество ядер 10,02 SCM :: GFP на каждую сторону (диапазон 9-11) (таблица 2). Точно так же у большинства Δmdf-2 только что вылупившихся личинок было 10 SCM :: GFP-положительных ядер со средним значением 9,75 и диапазоном 8-11 (таблица 2). Хотя непарный анализ t-критерия Стьюдента выявил значительную разницу (p = 0,012), как количественные, так и качественные дефекты, наблюдаемые в Δmdf-2 только что вылупившихся личинках, были намного менее серьезными, чем дефекты, наблюдаемые в L4 (непарный t-критерий, p = 3.35E-5) или взрослых (непарный t-критерий, p = 2,96E-12) (таблица 2). Таким образом, мы заключаем, что MDF-2 играет важную роль в развитии клеток постэмбрионального шва.

Недавно было сообщено, что MDF-1 играет важную роль в остановке соматических клеток, вызванной лишением питательных веществ [35]. А именно, было обнаружено, что гемизиготность mdf-1 вызывает увеличение числа шовных клеток с 10, наблюдаемых у червей L1 дикого типа, голодавших в течение четырех дней, до 12-17 в более чем половине mdf-1. (gk2) / + L1 черви.Чтобы проанализировать способность гемизигот mdf-2 (tm2190 ) останавливать пролиферацию во время диапаузы L1, мы морили голодом детенышей дикого типа и детенышей Δmdf-2 / + в течение четырех дней. Последующий анализ клеток шва показал, что ни у личинок дикого типа (n = 25), ни у Δmdf-2 / + (n = 25) личинок не было более 11 SCM :: GFP-положительных ядер, что указывает на вызванную голоданием задержку личинок L1. . Таким образом, в отличие от MDF-1, MDF-2 компонент SAC, по-видимому, не требуется для остановки соматического клеточного цикла, вызванной голоданием.

Дефект клеток шва

mdf-2 (tm2190 ) обусловлен дефектами деления клеток пролиферативного шва

Клетки шва имеют свойства, подобные стволовым клеткам, и делятся четыре раза в развивающейся личинке для поддержания самообновления и размножения. , и производить дифференцированные клетки [30]. Шесть из 10 эмбриональных клеток шва, h2, V1-V4 и V6, подвергаются самообновляющемуся делению расширения в L2, что приводит к увеличению количества клеток шва до 16 [30] (Figure 4B). Чтобы определить, вызван ли дефект клеток шва, наблюдаемый у Δmdf-2 гомозигот, дефектом пролиферативного деления клеток, мы определили количество SCM :: GFP-положительных ядер в поздних L2 и L3.Мы наблюдали в среднем 14,36 (n = 25) ядер клеток шва в конце L2 у Δmdf-2 гомозигот (дикий тип 15,76) и в среднем 14,08 (n = 25) ядер клеток шва в L3 в Δmdf. -2 гомозигот (15,96 дикого типа), что незначительно отличается от количества ядер SCM :: GFP, наблюдаемых на более поздних стадиях гомозигот Δmdf-2 (непарный t-тест, p = 0,7 и p = 0,8 соответственно) (таблица 2). Эти данные демонстрируют, что дефект клетки шва, наблюдаемый у Δmdf-2 гомозигот, наиболее вероятно обусловлен дефектами деления клеток в L2.

Затем мы исследовали, может ли уменьшение количества шовных клеток быть связано с нарушением клеточного цикла определенных шовных клеток (H0-2, V1-V6 или T). Мы подсчитали, как часто наблюдаемый дефект клетки шва является следствием сбоя в развитии клеточного цикла одной конкретной клетки (рис. 4C). Наш анализ включает только однозначные случаи, когда идентичность дефектных ядер могла быть определена (рисунки 5 и 6). Случаи, когда идентичность ядра дефектного шва неоднозначна, как на рисунке 6B, были исключены из анализа.Мы наблюдали дефекты во всех шовных клетках, H0-2, V1-V6 и T (рис. 4C), предполагая, что нарушение клеточного деления влияет на все клетки в шовной клеточной выстилке. Однако частота дефектов в ячейках шва разная. Например, дефект клеток шва H0 наблюдался только один раз у 251 животного (рис. 4C). Клетки H0 являются единственными клетками линии шовных клеток, которые не подвергаются постэмбриональному делению, что дополнительно подтверждает предыдущие данные о том, что дефект шовных клеток, наблюдаемый у гомозигот Δmdf-2 , в основном обусловлен постэмбриональными дефектами.Точно так же редко наблюдались дефекты h3, V5 и Т-клеток (рис. 4C). Напротив, частые дефекты наблюдались в шести ячейках шва, h2, V1-V4 и V6, которые претерпевают деление расширения с образованием дополнительных шести ячеек шва в L2 и выше. Эти данные подтверждают открытие, что дефекты клеток шва, вероятно, возникают у гомозигот L2 Δmdf-2 . Кроме того, мы количественно определили ядра дополнительных шовных клеток (Рисунки 5 и 4C) по сравнению с отсутствующими шовными клеточными ядрами (Рисунки 6 и 4C) и, как и ожидалось, мы заметили, что уменьшение количества SCM :: GFP-положительных ядер является гораздо более распространенным явлением. (Рисунок 4C).Репрезентативные изображения сокращения клеток шва из-за сбоя в развитии клеточного цикла определенного клона показаны на рисунке 6. Вместе эти данные показывают, что дефекты шва клеток в отсутствие MDF-2 в основном связаны с нарушением пролиферации клеток в L2, которое случайным образом влияет на клетки шва h2, V1-V4 или V6.

Уменьшение количества клеток шва в

mdf-2 (tm2190 ) вряд ли будет вызвано ced-3 зависимой гибелью клеток

Возможно, что уменьшение количества клеток шва у Δmdf-2 червей вызывается повреждением клеток, за которым следует апоптотическая гибель клеток.CED-3 является членом семейства каспаз цистеиновых протеаз, которые необходимы для гибели клеток у C. elegans [36]. Чтобы определить, может ли апоптотическая гибель клеток объяснять потерю клеток шва, мы сконструировали ced-3 (n717) unc-26 (e205) mdf-2 (tm2190 ), в котором гибель клеток отсутствует. Мы обнаружили, что мутантов ced-3 (n717) unc-26 (e205 ) не влияют на развитие шовных клеток, так как в среднем у молодых людей наблюдались 15,92 ядра шовных клеток (непарный t-критерий, p = 0,3, по сравнению с молодняк дикого типа) (таблица 3).Кроме того, мы обнаружили, что ced-3 (n717) unc-26 (e205) mdf-2 (tm2190 ) животных имели такое же количество ядер клеток шва (в среднем 14,27; непарный t-критерий, p = 0,98), что и mdf. -2 (tm2190) , предполагая, что ced-3 зависимая гибель клеток вряд ли ответственна за потерю клеток шва на фоне tm2190 .

Таблица 3 Среднее количество SCM :: GFP-положительных ядер, наблюдаемое в различных генетических фонах

Отсутствие FZR-1 увеличивает стерильность

мутантов mdf-2 , не оказывая какого-либо влияния на развитие клеток шва

Во время постэмбрионального развития шов деление клеток регулируется при прогрессировании фазы G1 в S с помощью каскада регуляторных факторов, которые включают LIN-35 / Rb, FZR-1 / Cdh2 и CKI-1 [37–42].Поскольку LIN-35 и FZR-1 действуют избыточно, чтобы контролировать прогрессирование фазы G1 в S, пролиферация шовных клеток, по-видимому, является нормальной у одиночных мутантов lin-35 и fzr-1 , тогда как обширная гиперпролиферация наблюдается у lin- 35 ; fzr-1 двойных мутантов [39]. Более того, одиночные мутанты lin-35, и fzr-1 устраняют дефекты клеток постэмбрионального шва у одиночных мутантов bro-1 [42]. bro-1 является гомологом C. elegans CBFβ, который необходим для нормальной пролиферации и дифференцировки шовных клеток [42].Чтобы определить, играют ли мутанты lin-35 и fzr-1 роль в пролиферации дефектных постэмбриональных клеток на фоне mdf-2 (tm2190 ), мы исследовали генетические взаимодействия, построив lin-35 (rr33 ) ; мдф-2 (тм2190 ) и фзр-1 (ок380) ; двойных мутантов mdf-2 (tm2190 ). Мы обнаружили, что 100% из лин-35 (rr33) ; Двойные мутанты mdf-2 (tm2190 ) стерильны, что затрудняет анализ развития клеток шва.Мы также обнаружили синтетическое усиленное взаимодействие между мутантами fzr-1 (ok380 ) и mdf-2 (tm2190 ) (рис. 7). Делеция ok380 удаляет 442 нуклеотида между интроном 3 и экзоном 3 и, как ожидается, приведет к усеченному FZR-1, который может быть или не быть функциональным. Гомозиготы fzr-1 (ok380 ) легко размножаются и не проявляют серьезных аномалий развития. Как сообщалось ранее, гомозигот mdf-2 (tm2190 ) могут поддерживаться при 20 ° C неопределенно долго, но демонстрируют сильно уменьшенный размер выводка примерно 40 потомков / червя (Рисунок 7A), из которых только 40% развиваются во взрослых особей [12] ( Рисунок 7B).Однажды мы построили Δfzr-1 ; Δmdf-2 гомозигот, мы сразу заметили, что этих червей чрезвычайно трудно размножать из-за небольшого числа потомков, которые достигают зрелого возраста. Наш подробный анализ Δfzr-1 ; Δmdf-2 Двойные мутанты показали, что у них значительно уменьшились размеры выводка (~ 11 потомков на червя) (рис. 7A) и значительно уменьшилось количество фертильных взрослых особей (~ 50% всего взрослого потомства плодовиты), в результате чего только два или три фертильных взрослых потомства на гермафродита по сравнению с примерно 10-15 фертильными взрослыми особями, произведенными гомозиготами Δmdf-2 (фигура 7).Кроме того, мы наблюдали, что в то время как Δmdf-2 гомозигот демонстрировали CIN, как определено по h igh i ncidence фенотипа m элей (Him) (~ 3% взрослого потомства — мужчины; n = 252), Δfzr-1 увеличивает эту хромосомную нестабильность до ~ 6% (n = 107 наблюдаемых взрослых потомков).

Рисунок 7

Генетические взаимодействия между mdf-2 (tm2190) / MAD2 , fzr-1 (ok380) / CDh2 и fzy /1 CDC20 .(A) Размер выводка — подсчитывается как общее количество яиц, отложенных червем. (B) Жизнеспособность — подсчитывается как процент от потомства, которое развилось до взрослого возраста. (C) Фертильность — процент плодовитых взрослых потомков.

Хотя Δfzr-1 ; Δmdf-2 двойных мутантов трудно выращивать, мы собрали достаточно взрослых потомков для анализа пролиферации клеток постэмбрионального шва. Как и ожидалось, мы обнаружили, что Δfzr-1 гомозигот (n = 50) имели в среднем 15,98 SCM :: GFP-ядер (таблица 3), что незначительно отличалось от дикого типа (непарный t-критерий, p = 0.8). Однако мы обнаружили, что Δfzr-1 не влиял на пролиферацию клеток шва на фоне mdf-2 (tm2190 ), как Δfzr-1 ; Δmdf-2 двойных мутантов имели в среднем 14,82 (таблица 3) ядер клеток шва, существенно не отличавшихся от Δmdf-2 животных (непарный t-критерий, p = 0,6). Взятые вместе, эти данные предполагают, что, хотя mdf-2 демонстрирует синтетическую летальность и усиленный фенотип с lin-35, и fzr-1 , этот путь маловероятно объясняет дефект пролиферации постэмбриональных клеток, наблюдаемый в отсутствие MDF-2. веретено-контрольная точка с использованием линии швов клеток.

Гипоморфный мутант

fzy-1 (h2983 ) частично подавляет летальность мутантов mdf-2 и полностью устраняет дефекты шовных клеток

Гипоморфный мутантный аллель fzy-1 , h2983 был выделен из скрининга. для супрессоров летального фенотипа mdf-1 (gk2 ) в поисках дополнительных компонентов, которые функционируют при переходе из метафазы в анафазу [43]. Аллель h2983 является миссенс-мутацией, и образующийся мутантный белок FZY-1D433N не может должным образом связываться с субстратом APC / C IFY-1 (секурин) [43].Впоследствии было показано, что fzy-1 (h2983 ) спасает mdf-1 (gk2 ) летальности, вероятно, за счет отсрочки наступления анафазы, поскольку продолжительность митоза у fzy-1 (h2983 ) эмбрионов на ранней стадии увеличивается. , предположительно из-за повышенного уровня секурина [44]. Хотя основной функцией MDF-1 может быть регуляция активности APC / C [43, 44], точная роль MDF-2 в настоящее время неизвестна.

гомозиготы fzy-1 (h2983 ) могут легко размножаться, и этот штамм демонстрирует небольшое уменьшение размера выводка и увеличение числа самцов без явных отклонений в росте или морфологии [43].Чтобы определить, может ли fzy-1 (h2983 ) снизить летальность mdf-2 (tm2190) , мы сконструировали fzy-1 (h2983) ; мдф-2 (тм2190) . Мы наблюдали, что fzy-1 не оказывает значительного влияния на размеры расплода Δmdf-2 гомозигот (фигура 7A). Однако fzy-1 ; Δmdf-2 червей производят в среднем 85% потомков, которые развиваются во взрослых особей, по сравнению с ~ 40%, наблюдаемыми для Δmdf-2 гомозигот (рис. 7B). Кроме того, большинство (~ 95%) из fzy-1 ; Δmdf-2 Потомство взрослых является фертильным (фиг. 7C), что позволяет предположить, что fzy-1 (h2983 ) может подавлять стерильность, вызванную отсутствием MDF-2.Кроме того, мы наблюдали, что fzy-1 снижает заболеваемость самцов с ~ 3%, наблюдаемых у гомозигот Δmdf-2 , до ~ 0,8%, наблюдаемых у двойных мутантов. Вместе эти данные дополнительно подтверждают, что подобно MDF-1, MDF-2 регулирует активность APC / C ^CDC20 во время развития.

Затем мы исследовали, влияет ли fzy-1 (h2983 ) на развитие клеток шва. Интересно, что мы обнаружили, что гомозигот fzy-1 (h2983 ) имели в среднем 16,04 (таблица 3) ядер шва, существенно не отличающихся от животных дикого типа (непарный t-критерий, p = 0.8). Кроме того, развитие клеток шва в fzy-1; Двойные мутанты Δmdf-2 оказались полностью нормальными (таблица 3). А именно fzy-1; Двойные мутанты Δmdf-2 имели в среднем 16,08 (таблица 3) ядер клеток шва, существенно не отличающихся от гомозиготных животных дикого типа или fzy-1 (h2983 ) (непарный t-критерий, p = 0,8). Кроме того, большинство из проанализированных fzy-1; Δmdf-2 молодых людей имели 16 равномерно расположенных и выровненных ядер SCM :: GFP. Эти результаты предполагают, что MDF-2 играет важную роль в пролиферации клеток постэмбрионального шва, ингибируя активность APC / C ^CDC20 .

Спецификация формата Формат MDF — вектор 3.3.1 Спецификация формата Формат MDF 1. … 1.9 2013-06-25 Osr Добавлена ​​подсказка, что последний член CGBLOCK действителен только для MDF 3.30 или … MDF

Кишечные вирусы вызывают широкий иммунный ответ хозяина, напоминающий бактериальный микробиом

ВВЕДЕНИЕ

Наши симбиотические отношения с микробиотой кишечника иллюстрируют коадаптацию микроба и хозяина.Помимо взаимовыгодного обмена питательными веществами, колонизация кишечника бактериями формирует развитие и функционирование иммунной системы млекопитающих (Honda, Littman, 2012; Round and Mazmanian, 2009). Различные бактерии вызывают контекстно-зависимые ответы, которые влияют на программу экспрессии генов паренхимы и дифференциацию субпопуляций лейкоцитов (Atarashi et al., 2011; Ivanov et al., 2009; Mazmanian et al., 2005). Результат этих реакций может быть благоприятным, например, при устойчивости к колонизации к патогенам, или неблагоприятным, например, при хронических заболеваниях, таких как воспалительное заболевание кишечника (ВЗК).Исследования реакции хозяина на отдельные виды бактерий с использованием животных-гнотобиотов привели к важному пониманию ряда иммунных процессов, которые тонко настраиваются микробиотой кишечника (Geva-Zatorsky et al., 2017; Sefik et al., 2015a; Tan и др., 2016).

По сравнению с бактериями, последствия колонизации кишечника грибами, простейшими и вирусами для иммунной системы слизистых оболочек менее изучены. Эукариотические вирусы занимают потенциально уникальную иммунологическую нишу.Вирусы, реплицируясь в клетках млекопитающих, изменяя сигнальные каскады и пути мембранного переноса, распознаются сенсорами нуклеиновых кислот и механизмом презентации антигена и часто распространяются в другие места как внутриклеточные пассажиры. Кишечные эукариотические вирусы обнаруживаются в образцах фекалий здоровых младенцев уже через несколько дней после рождения и становятся все более распространенными и разнообразными в процессе развития (Liang et al., 2020; Lim et al., 2015). Метагеномный анализ вирусного микробиома (вирома) связывает различные вирусы с кишечными расстройствами, такими как ВЗК (Norman et al., 2015; Нюстрём и др., 2013; Унгаро и др., 2019). Кроме того, как преходящие, так и стойкие инфекции предшествуют аутоиммунным заболеваниям, что наблюдается при длительном присутствии энтеровируса и развитии диабета 1 типа (СД1) (Vehik et al., 2019; Zhao et al., 2017), что позволяет предположить, что воздействие вируса имеет длительное время. срочные иммунные последствия.

Наши исследования с мышиным норовирусом (MNV) показывают, что эукариотические вирусы могут устанавливать симбиотические отношения с хозяином, подобным комменсальным бактериям. У мышей, лишенных зародышей (GF) или обработанных антибиотиками, обнаруживаются многочисленные дефекты кишечника, в том числе пониженное количество резидентных Т-клеток и подверженность химическому повреждению (Round and Mazmanian, 2009).Инокуляция стойким штаммом MNV, CR6, устраняет эти дефекты, индуцируя интерферон I типа (IFN-I), что указывает на то, что противовирусный ответ может давать сигналы развития, подобные тем, которые приписываются бактериальной микробиоте (Kernbauer et al., 2014). Кроме того, колонизация MNV является защитной в моделях детских кишечных бактериальных инфекций и внутрибольничных оппортунистических инфекций (Abt et al., 2016; Neil et al., 2019). Подобно симбиотическим бактериям, MNV вызывает неблагоприятные последствия при попадании на чувствительный фон.Цитокины Th2, индуцированные MNV, вызывают заболевание на животных моделях ВЗК (Basic et al., 2014; Bolsega et al., 2019; Cadwell et al., 2010; Matsuzawa-Ishimoto et al., 2017), а экспрессия воспалительных генов индуцирована. от MNV обостряет бактериальный сепсис (Kim et al., 2011). Точно так же MNV и штамм ортореовируса типа 1 Lang (T1L), который вызывает бессимптомную или легкую желудочно-кишечную инфекцию у людей, вызывает ответ Th2, который вызывает потерю иммунологической толерантности к диетическому глютену на мышиной модели целиакии (Bouziat et al., 2017, 2018). Ротавирус резус (RRV) ускоряет аутоиммунитет у мышей с диабетом, не страдающих ожирением, после распознавания плазматическими дендритными клетками (pDC) (Drescher et al., 2015; Pane and Coulson, 2015). Эти наблюдения могут объяснить эпидемиологическую связь между родственными вирусами и заболеванием у людей (Axelrad et al., 2018, 2019; Bouziat et al., 2017; Pane and Coulson, 2015).

Несмотря на доказательства того, что эукариотические вирусы в кишечнике оказывают как положительное, так и отрицательное воздействие на хозяина, влияя на развитие иммунной системы, более широкая характеристика иммунных эффектов вирусного воздействия отсутствует.Введение противовирусных препаратов обычным мышам снижает количество интраэпителиальных лимфоцитов, уровни цитокинов и устойчивость к повреждению кишечника за счет IFN-зависимых и независимых механизмов, что позволяет предположить, что кишечные вирусы предоставляют хозяину широкий спектр гомеостатических сигналов (Broggi et al., 2017 ; Liu et al., 2019; Yang et al., 2016). Однако вклад отдельных вирусов неясен.

Здесь мы провели исчерпывающее перекрестное сравнение реакции хозяина и динамики колонизации репрезентативных кишечных вирусов.Почти все исследованные нами вирусы вызвали реакцию хозяина в отсутствие проявлений болезни, и многие из них продемонстрировали повышенную способность к сохранению у мышей GF. Эксперименты по моноассоциации выявили длительные и специфические эффекты отдельных вирусов на популяции иммунных клеток и экспрессию генов. Сравнение с мышами, ассоциированными с бактериями, и исследования, определяющие реакцию хозяина на отдельные виды бактерий, выявили частично совпадающие, но отчетливые последствия воздействия вируса. Эти результаты обеспечивают обзор иммунного пространства, занимаемого кишечным виромом, и подчеркивают широкий спектр ответов, которые могут возникнуть после бессимптомной вирусной инфекции.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Колонизация и бактериальная зависимость кишечных вирусов после естественного пути инокуляции

Изучение вирусного комменсализма затруднено из-за отсутствия известных животных моделей. Установленные модели часто включают перитонеальную или внутривенную инокуляцию вируса для обхода местной защиты или использования ингибирования противовирусных путей с использованием нокаутных мышей. Другая проблема связана со способностью сегментированных нитчатых бактерий (SFB) и мышиного астровируса, которые широко распространены в институциональных вивариях, подавлять инфекции, вызываемые по крайней мере некоторыми вирусами в кишечнике (Ingle et al., 2019; Ши и др., 2019). Таким образом, бактериальная или вирусная микробиота могла помешать исследованию определенных вирусов. Эти опасения побудили нас провести параллельное сравнение вирусной нагрузки после пероральной инокуляции обычных мышей, свободных от специфических патогенов (SPF) и GF, различными кишечными вирусами.

Мы выбрали панель из 10 штаммов кишечных вирусов, охватывающих шесть семейств, составляющих группы I, II, III и IV по балтиморской классификации: два аденовируса (MAdV1 и 2), астровирус (MuAstV), два калицивируса (MNV CR6 и CW3). ), пикорнавируса (CVB3), двух парвовирусов (MVMi и MVMp) и двух реовирусов (T1L и RRV).Эти вирусы инфицируют мышей, но подробный временной ход инфекции и соответствующий иммунный ответ у мышей C57BL / 6 дикого типа после пероральной инокуляции для большинства из них не определен. Обычных мышей и мышей GF, инокулированных каждым вирусом, отслеживали на предмет признаков заболевания и вируса в стуле и крови в течение 2-месячного периода. Мы не смогли извлечь инфекционные частицы из MNV CW3 на пике инфекции и обнаружили, что содержимое стула препятствует обнаружению инфекционных вирусных частиц, что не позволяет использовать анализ бляшек во всех условиях (рис.S1A). Связанная с этим проблема заключается в том, что обнаружение инфекционных частиц может быть подвержено ложноотрицательным результатам после выработки нейтрализующих антител, особенно для образцов крови. Поэтому мы использовали количественную ПЦР, которая является чувствительным методом для мониторинга клиренса вирусов и облегчения сравнения вирусов. T1L и RRV были исключениями, для которых мы использовали анализы бляшек, поскольку многосегментный характер генома Reoviridae затрудняет количественную оценку с помощью qPCR.

Рисунок S1. Инфекция кишечным вирусом у обычных мышей и мышей GF

(A) Инкубация RRV при 37 ° C в течение 1 часа с очищенным лизатом стула, но не с кровью, приводит к снижению количества бляшкообразующих единиц (БОЕ).Значения были нормализованы к количеству бляшек, наблюдаемых при параллельном хранении одного и того же запаса RRV при 4 ° C. Данные представляют два независимых эксперимента. Точки обозначают копии одного репрезентативного эксперимента. Статистическую значимость рассчитывали с помощью ANOVA с последующим апостериорным анализом Данна.

(B) GF мышей, инокулированных энтеросолюбильными вирусами, показанными на рисунке 1, оценивали в указанные дни после прививки (dpi) на диарею (0: без диареи, 2: водянистый стул), сутулость (0: без сутулости, 2 : сгорбившись) и видимую кровь в стуле (0: нет, 1: да).Для справки, комбинированный балл заболевания показан для четырех мышей GF, перорально инокулированных Yersinia Pseudotubercolosis на 7 день в двух независимых экспериментах.

(C) Окрашенные H и E срезы тонкой кишки (слева) и толстой кишки (справа) мышей GF с разрешением 28 dpi, что указывает на отсутствие явного воспаления. Полоса показывает 100 мкм.

(D) Выживание 15 обычных мышей и 9 мышей GF, перорально инокулированных CVB3, в четырех независимых экспериментах.

(E) Сравнивали динамику вирусных нагрузок в кале и крови обычных мышей по сравнению с мышами GF с фиг. 1 для выявления значительных различий в пиковом титре и продолжительности.Статистическая значимость пикового титра рассчитывалась с использованием непараметрического теста Манна-Уитни в момент времени с наивысшим титром вируса у мышей GF. Зеленая стрелка вверх и красная стрелка вниз указывают на увеличение и уменьшение титра вируса у мышей GF соответственно. Статистическая значимость продолжительности выделения вируса рассчитывалась с использованием лог-рангового теста. Зеленая стрелка, направленная вправо, указывает на длительное обнаружение вируса у мышей GF. Серые прямоугольники указывают на условия, при которых вирусы не были обнаружены в крови.Значения в скобках обозначают p-значения.

Признаки симптомов заболевания, таких как диарея и сутулость, отсутствовали почти у всех мышей, а оценка тканей кишечника, собранных через 28 дней после инокуляции (dpi), не дала доказательств гистологических аномалий (рис. S1B-C). Мыши, инокулированные CVB3, были единственными животными, у которых постоянно проявлялось заболевание. Несмотря на введение самой низкой дозы вируса, необходимой для сероконверсии, ~ 50% обычных мышей и мышей GF не выжили (рис.S1D). Учитывая наше внимание к комменсализму, мы исключили CVB3 из последующих исследований. Мы обнаружили репликацию каждого из оставшихся девяти вирусов как у обычных мышей, так и у мышей GF (рис. 1A-B). Хотя нам не удалось обнаружить RRV в стуле или крови, мы обнаружили нейтрализующие антитела против RRV, что указывает на инфекцию (рис. 1C). Геномы MAdV1, MuAstV и MVMi были обнаружены в крови в двух или более временных точках. Как правило, наличие этих вирусов в крови предсказывало их долгосрочное обнаружение в кале (30 точек на дюйм).

Рис. 1. Колонизация и бактериальная зависимость кишечных вирусов естественным путем заражения

(AB) Стул (A) и кровь (B) были собраны в указанные временные точки у обычных (черных) мышей и мышей GF (окрашенные), инокулированных показан вирус. Титры вирусов определяли количественно с помощью анализа бляшек или количественной ПЦР. Символами обозначены отдельные образцы. Линии проходят через среднее значение в каждый момент времени. Затененные области указывают на SEM. Серые области указывают предел обнаружения. N = 4-8 мышей на одно условие, объединенные из двух независимых экспериментов.

(C) Нейтрализующие антитела в сыворотке мышей через 28 дней после инокуляции (dpi), инокулированных RRV, были количественно определены с помощью анализа нейтрализации уменьшения бляшек. Снижение бляшкообразующих единиц (БОЕ) показано в процентах относительно контрольной сыворотки от наивных обычных мышей. Результаты получены для 3-9 мышей из трех независимых экспериментов. н.о .: не определено.

Наблюдения, проведенные на мышах, получавших антибиотики, и мышах GF, показывают, что микробиота необходима для оптимального инфицирования и передачи определенных кишечных вирусов (Baldridge et al., 2015; Кейн и др., 2011; Kernbauer et al., 2014; Kuss et al., 2011), что мы подтвердили для MNV CR6. Удивительно, но большинство других вирусов продемонстрировали аналогичную или усиленную колонизацию мышей GF, включая близкородственный MNV CW3 (рис. 1A-B и S1E). Это очевидное противоречие можно объяснить недавним исследованием, показывающим, что бактериальное истощение подавляет инфекцию MNV CW3 в одной области кишечника, одновременно способствуя репликации вируса в другой (Grau et al., 2020). Также возможно, что мыши GF более восприимчивы к вирусам, потому что некоторые аминогликозиды, используемые в качестве антибиотиков для уничтожения бактерий у мышей, вызывают противовирусный ответ IFN-I (Gopinath et al., 2018). MadV1 и T1L достигли более высоких пиковых титров у мышей GF, но микробиота не влияла на время до выведения (рис. S1E). Напротив, MNV CW3, MAdV2, MVMi и MVMp давали аналогичные пиковые титры, но пролонгировали вирусное выделение в стуле (рис. S1E). MuAstV не всегда обнаруживался в стуле обычных мышей, что, возможно, отражает ранее существовавший иммунитет (Yokoyama et al., 2012), но стабильно высокие уровни вирусной РНК были получены от мышей GF (рис. 1A-B). В совокупности эти данные показывают, что воздействие кишечных вирусов может происходить в отсутствие явного заболевания, и многие из вирусов, выбранных для исследования, показали улучшенную колонизацию у мышей GF.Эти результаты, обобщенные в таблице 1, были использованы для разработки и интерпретации последующего анализа иммунного ответа, вызванного этими вирусами.

Таблица 1: Сводка характеристик вирусов.

Таксономическая классификация на уровне семьи и рода, классификация Балтимора, названия штаммов вирусов с их сокращениями (Abbr.) И сводка результатов после инокуляции стерильных (GF) мышей с рис. 1 и S1 для каждого вируса, использованного в данном исследовании. изучение. Вирусы классифицировались как стойкие, если вирусная нуклеиновая кислота была обнаружена через 30 дней после инокуляции (dpi) в крови или стуле после пероральной инокуляции.Виремия определяется как присутствие вирусной нуклеиновой кислоты в крови по крайней мере в один момент времени. Способность вызывать патологию основана на появлении гистологических или макроскопических признаков заболевания, таких как летальность или диарея. н.о .: не определено.

Редукционистский подход к оценке ответов на воздействие вируса

Чтобы определить, связаны ли бессимптомные вирусные инфекции с устойчивыми иммунологическими изменениями, мы провели иммунопрофилирование мышей, инфицированных каждым вирусом, редукционистский метод, аналогичный тому, который использовался для определения иммуномодулирующей активности отдельных видов бактерий (Гева-Заторский и др., 2017; Сефик и др., 2015а; Tan et al., 2016). Хотя отдельные инфекции могут потенциально преувеличивать эффект отдельного вируса, этот подход позволяет избежать опасений по поводу избыточности между вирусами в нашей панели и вирусными и бактериальными членами микробиоты.

Мы перорально инокулировали мышей GF каждым вирусом и подтвердили инфекцию при 5 dpi. При разрешении 28 dpi были собраны шесть кишечных и внекишечных тканей для анализа с помощью многоцветной проточной цитометрии: собственная пластинка толстой и тонкой кишки (cLP и siLP), интраэпителиальные лейкоциты тонкой кишки (IELs), мезентериальные лимфатические узлы (mLNs), селезенка. , и легкие.Каждый образец анализировали на 32 подмножества иммунных клеток на основе маркеров клеточной поверхности и факторов транскрипции. Подмножества лимфоцитов и их функциональность были дополнительно определены путем внутриклеточного окрашивания шести эффекторных цитокинов (GRANZYME-B, IL-4, IL-10, IL-17a, IL-22 и IFN-γ) (фиг. S2). Гомогенаты всей толстой и тонкой кишки подвергали секвенированию РНК для изучения транскрипционных ответов. Эти образцы сравнивали с образцами, полученными параллельно от контрольных мышей GF и мышей GF, колонизированных минимально определенной флорой (MDF), состоящей из консорциума из 15 бактериальных штаммов, представляющих микробиоту кишечника мышей (Brugiroux et al., 2016). В результате этих экспериментов было получено 462 образца проточной цитометрии, из которых мы получили 21 619 индивидуальных иммунофенотипов и 127 транскриптомов.

Рисунок S2. План эксперимента и стратегия гейтинга

(A) План эксперимента для иммунного профилирования мышей, инфицированных вирусом. Мышей в возрасте от пяти до шести недель не лечили или инокулировали вирусами или бактериями. Через четыре недели после инокуляции оценивали влияние на иммунные клетки и транскриптом. Было проанализировано от пяти до восьми мышей на каждое условие.Чтобы гарантировать, что каждое состояние было представлено по крайней мере в двух независимых экспериментах, представлены результаты 11 независимых экспериментов с 8-12 мышами и включают контрольных необработанных мышей GF в каждый независимый эксперимент. Подготовлено с помощью BioRender.com.

(B-D) Стратегии стробирования проточной цитометрии для B-клеток и миелоидных клеток (B), T-клеток и ILC (C, факторы транскрипции) и продукции цитокинов (D).

Кишечные вирусы способствуют изменениям популяций иммунных клеток

Соответствующие кратные изменения популяций иммунных клеток относительно статуса GF показаны в Таблице S1 и тепловых картах на Рисунке 2A (cLP и siLP) и Рисунке S3 (IELs, млN, легкие, и селезенка).Вирусная инфекция способствует расширению или сокращению множества популяций, особенно cLP и siLP. Хотя каждый вирус имел уникальный эффект, общие изменения популяции изменялись однонаправленно; мы редко наблюдали популяцию, которая увеличивалась с одним вирусом и уменьшалась с другим. Было обнаружено, что вирусы модулируют столько же иммунных субпопуляций, сколько контролируют бактериальную микробиоту MDF (рис. 2A), что позволяет предположить, что вирусы формируют иммунные ответы кишечника.

Рисунок S3. Кишечные вирусы способствуют изменениям в популяциях иммунных клеток вне кишечных тканей

Тепловая карта, показывающая среднее кратное изменение для каждой иммунной популяции относительно GF в IELs, млN, селезенке и легких с FDR <0.1. Серый: FDR> 0,1.

Рис. 2. Кишечные вирусы способствуют изменениям в популяциях иммунных клеток

(A) Тепловая карта, показывающая среднее кратное изменение для иммунных популяций cLP и siLP, идентифицированных с помощью проточной цитометрии (с использованием стратегии стробирования на рис. S2) для мышей, инокулированных отдельными вирусами или MDF относительно контроля GF с FDR <0,1. Серый: FDR> 0,1. Гистограмма сверху представляет долю иммунных популяций с FDR <0,1 и кратным изменением> 1,5.

(BE) Фолд-изменения CD62L ⁺ CD44 ^— (B), CD62L ^— CD44 ⁺ (C), T-bet ⁺ (D) и pDC (E) в cLP Популяции CD4 ⁺ (BD), CD8 ⁺ (BC) или CD45 ⁺ (E).Каждая точка представляет собой отдельный образец.

(F-G) Процент клеток Foxp3 ⁺ в популяциях cLP (F) или siLP (G) CD4 ⁺ . Каждая точка представляет собой отдельный образец.

(H-I) Иерархическая кластеризация различных состояний на основе частот популяции cLP (H) и siLP (I).

(J-K) Величина эффекта, определяемая db-RDA вирусных характеристик: идентичность , геном , персистентность и виремия в качестве независимых переменных для дисперсии популяционной частоты cLP (J) и siLP (K).Круговые диаграммы представляют совокупный эффект генома , персистентности и виремии . Статистическую значимость рассчитывали с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим апостериорным анализом Данна и корректировали для множественного тестирования с помощью процедуры Бенджамини-Хохберга (A-E) или непараметрического критерия Манна-Уитни (F-G).

Наши результаты подтвердили несколько ожидаемых результатов, подтверждая обоснованность нашего подхода. Мы наблюдали снижение CD4 ⁺ и CD8 ⁺ наивных Т-клеток (CD62L ⁺ CD44 ^— ) и соответствующее увеличение CD4 ⁺ и CD8 ⁺ Т-лимфоцитов эффекторной памяти (CD62L ^— ). CD44 ⁺ ) (рис.2Б-С). Мы также обнаружили увеличение T-bet ⁺ Т-клеток, что свидетельствует о Th2-ответе (рис. 2D) (Szabo et al., 2000). Наш скрининг выявил увеличение макрофагов в cLP в ответ на MNV CW3, что согласуется с эффектами у обычных мышей, инокулированных этим вирусом (Winkle et al., 2018). Кроме того, по крайней мере три энтеросолюбильных вируса вызвали рост пДК толстой кишки (рис. 2E), популяции, сильно модулируемой бактериальной микробиотой (Geva-Zatorsky et al., 2017). Несмотря на эту общность, совпадение между мышами, инокулированными вирусами, и MDF было ограниченным.Одним из наиболее заметных эффектов MDF была индукция клеток FOXP3 ^— RORγt ⁺ CD4 ⁺ Th27, но влияние вирусного воздействия на эту популяцию было незначительным (рис. 2А). Вместо этого мы наблюдали увеличение FOXP3 ⁺ CD4 ⁺ T-клеток (Tregs) за счет MVMi в cLP (рис. 2F) и за счет T1L и MAdV1 в siLP (рис. 2G). Отсутствие RORγt в этой популяции (рис. 2A) предполагает, что эти Treg отличаются от индуцированных бактериями периферических Treg (Sefik et al., 2015b).

Мы использовали иерархическую кластеризацию, чтобы определить относительное сходство общего состава иммунных клеток между состояниями (рис. 2H-I). Как в cLP, так и в siLP, MDF находился в кладе, отличной от отдельных вирусов и контроля GF. Вирусы не разделялись на основании таксономических отношений, что позволяет предположить, что наблюдаемые иммуномодулирующие свойства были незначительно присущи вирусному семейству или роду. Чтобы количественно оценить, как связанные с вирусом переменные могут объяснить различия, наблюдаемые между образцами, мы провели анализ избыточности на основе расстояния (db-RDA), основанный на общих характеристиках (таблица 1): тип генома (ДНК по сравнению с РНК), способность сохраняться в хозяин, определяемый как обнаруживаемый вирус 30 dpi в крови или стуле ( персистентность ) и обнаруживаемый вирус в крови ( виремия ).Мы включили идентичность вируса ( идентичность ) в качестве контрольной переменной в этот анализ. Действительно, идентичность была основной объясняющей переменной, которая сама по себе составляла почти 25% дисперсии, подтверждая вывод о том, что отдельные вирусы способствуют существенно различным иммуномодулирующим результатам (рис. 2J-K). Второй по значимости независимой переменной был тип , геном , хотя величина эффекта была скромной. Суммарный размер эффекта переменных генома , персистентности и виремии оставил большую часть дисперсии необъяснимой, указывая на то, что различия в иммунных ответах на эти вирусы, вероятно, связаны со сложными взаимодействиями между каждым вирусом и хозяином.

Среди других исследованных тканевых компартментов, mlN и легкие показали наибольшие изменения в иммунных клетках после вирусной инфекции (рис. S3). Как и в собственной пластинке кишечника, мы наблюдали, в меньшей степени, уменьшение наивных и увеличение эффекторной памяти CD4 ⁺ и CD8 ⁺ Т-клеток в легких. В совокупности эти данные указывают на то, что кишечные вирусы влияют на состав иммунных клеток наивного хозяина, большая часть которых является специфичной для штамма вируса. Даже для нестабильных вирусов изменения частоты иммунных клеток наблюдались у мышей спустя много времени после последней временной точки, в которой была обнаружена вирусная нуклеиновая кислота.

Кишечные вирусы увеличивают продукцию цитокинов иммунными клетками

Параллельно с вышеуказанными анализами мы оценивали продукцию цитокинов после стимуляции PMA-иономицином суспензий отдельных клеток из каждой ткани (рис. 3A, S4A и таблица S1). Инокуляция несколькими вирусами приводила к увеличению количества Т-клеток cLP, продуцирующих цитокин Th2, IFN-γ (фиг. 3B), что коррелировало с увеличением T-bet ⁺ лимфоцитов (фиг. S4B). Увеличение количества Т-клеток IL-17 ⁺ CD4 ⁺ было специфичным для мышей, колонизированных MDF (рис.3А). IL-22 представляет собой цитокин, регенерирующий ткань, который опосредует защитный эффект MNV в моделях повреждения кишечника и бактериальной инфекции (Abt et al., 2016; Neil et al., 2019). Большинство вирусов усиливали продукцию IL-22 различными лимфоидными клетками cLP и siLP, включая T-клетки CD4 ⁺ , T-клетки γδ ⁺ и ILC (рис. 3A). Количественная оценка общего количества клеток IL-22 ⁺ с использованием включающих ворот CD45 ⁺ в нашем протоколе профилирования показала, что cLP, инфицированный шестью вирусами, и siLP, инфицированный пятью вирусами, увеличивают общую долю клеток, продуцирующих IL-22. (Рис.3C-D). Эта продукция IL-22 клетками CD45 ⁺ коррелировала с долей гранулоцитов и мононуклеарных фагоцитов в cLP (фиг. S4C). Увеличение количества клеток IL-22 ⁺ было очевидным у мышей, которым были привиты неперсистентные вирусы, в первую очередь T1L, что указывает на то, что изменения в функции иммунных клеток могут сохраняться долгое время после того, как вирус находится ниже порога обнаружения ( Рис. 3A).

Рисунок S4. Кишечные вирусы увеличивают продукцию цитокинов иммунными клетками во внекишечных тканях

(A) Тепловые карты, показывающие среднее кратное изменение популяций цитокин-продуцирующих иммунных клеток для указанных состояний относительно мышей GF в IELs, млN, селезенке и легких с FDR <0.1. Серый: FDR> 0,1.

(B-C) Корреляция Пирсона между указанными популяционными частотами в cLP. Черные точки: образцы, инфицированные вирусом; серые точки: образцы GF.

Рисунок 3. Кишечные вирусы увеличивают продукцию цитокинов иммунными клетками

(A) Тепловые карты, показывающие среднее кратное изменение для цитокин-продуцирующих иммунных клеток в cLP и siLP, идентифицированных с помощью проточной цитометрии для мышей, инокулированных показанными вирусами или MDF по сравнению с контролями GF с FDR <0,1. Серый: FDR> 0,1.

(BD) Фолд-изменения IFN-γ ⁺ (B) и IL-22 ⁺ (CD) клеток в cLP CD4 ⁺ и CD8 ⁺ (B), cLP CD45 ⁺ (C) и siLP CD45 ⁺ (D).

(E-F) Типичная точечная диаграмма (E) и процент клеток IFN-γ ⁺ IL-10 ⁺ в популяции cLP CD4 ⁺ Т-клеток (F).

(G-H) Иерархическая кластеризация различных микробных ассоциаций на основе частот продукции цитокинов cLP (G) и siLP (H).

(I-J) Величина эффекта, определяемая db-RDA вируса в качестве объясняющих переменных cLP (J) и siLP

(K), вариабельность частоты иммунных клеток, продуцирующих цитокины. Круговые диаграммы представляют совокупный эффект генома , персистентности и виремии .Статистическая значимость была рассчитана с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим апостериорным анализом Данна и скорректирована на множественное тестирование с помощью процедуры Бенджамини-Хохберга (AB), теста Краскела-Уоллиса с последующим апостериорным анализом Данна (CD) или не -параметрический критерий Манна-Уитни (F).

Хотя мы не наблюдали общих изменений в способности продуцировать цитокины в других тканевых компартментах, как мы наблюдали для IL-22 в собственной пластинке, мы отметили несколько изменений в пропорции цитокин-продуцирующих иммунных клеток, которые были специфичными для штамма вируса. (Рис.S4A). Например, IFN-γ ⁺ IL-10 ⁺ CD4 ⁺ Т-клетки (клетки Tr1), подмножество Т-хелперов с регуляторными функциями (Häringer et al., 2009), было увеличено у мышей, инфицированных персистирующий штамм CR6 MNV в cLP и mLN (рис. 3E-F).

Иерархическая кластеризация продукции цитокинов в клетках cLP и siLP показала, что инфицированные вирусом мыши не формировали клады, независимые от мышей GF и MDF, с такой очевидностью, как при анализе популяций иммунных клеток на основе маркеров клеточной поверхности и факторов транскрипции (рис.3G-H). Как и в предыдущих анализах, вирусы из одних и тех же семейств не группировались вместе однородно, и основными объясняющими переменными для продукции цитокинов были идентичность , за которой следует геном (фиг. 3I-J). В совокупности эти результаты показывают, что у инфицированных вирусом мышей наблюдается увеличение количества иммунных клеток, продуцирующих цитокины, которые являются как общими, так и специфичными для штамма вируса.

Кишечный транскриптом мышей, инфицированных вирусом

Из генов, профилированных в толстой и тонкой кишке, 497 и 355, соответственно, демонстрировали дифференциальную экспрессию (DE) по крайней мере в одном состоянии вирусной инфекции по сравнению с мышами GF (≥2-кратная , значение p ≤ 0.01) (Рис. 4A-C, Таблица S2A-B). Для сравнения, гены 146 и 92 в толстой и тонкой кишке демонстрировали дифференциальную экспрессию у мышей, колонизированных MDF, и минимально перекрывались с изменениями экспрессии, вызванными вирусом (фиг. 4D-E, таблица S2C-D). Анализ онтологии генов (GO) показал, что вирусная инфекция влияет на широкий спектр иммунных путей, особенно в толстой кишке (рис. 4F-G). Вирусная инфекция была связана с антивирусными путями иммунитета, такими как защитный ответ на вирус и клеточный ответ на интерферон-бета .Обогащение генов, связанных с IFN-γ, согласуется с данными проточной цитометрии, идентифицирующими ответ Th2. И MDF, и вирусы были связаны с активацией B-клеток и путями бактериального ответа. Обогащение генов DE, участвующих в метаболических процессах, было специфическим для MDF, возможно, отражая обмен питательными веществами между хозяином и бактериями.

Рисунок 4. Кишечный транскриптом мышей, инфицированных вирусом

(A-B) Тепловые карты, показывающие гены DE (| среднее кратное изменение по GF | ≥2 и нескорректированное значение p≤0.01) в толстой (A) и тонкой кишке (B) мышей, инфицированных вирусом, по сравнению с мышами GF. C: толстая кишка; SI: тонкий кишечник.

(C) Количество генов DE в транскриптоме толстой и тонкой кишки для каждого состояния по сравнению с мышами GF.

(D-E) Диаграммы Венна, изображающие количество и перекрытие генов DE у всех инфицированных вирусом и ассоциированных с MDF мышей в толстой кишке (D) и тонком кишечнике (E).

(F-G) Топ-15 наиболее высокообогащенных терминов GO для биологических процессов для генов DE в толстой (F) и тонкой кишке (G) мышей, инфицированных вирусом, и мышей, ассоциированных с MDF.

(H-I) Тепловые карты, показывающие евклидовы расстояния между групповыми центрами генов DE в толстой кишке

(H) и тонкой кишке (I), сравнивающие каждое состояние. Прямоугольники, обведенные черным цветом, указывают на существенные различия (PERMANOVA <0,05).

(J-K) Величина эффекта определяется db-RDA характеристик вируса как объясняющих переменных вариации гена DE в толстой (J) и тонкой кишке (K). Круговые диаграммы представляют совокупный эффект генома , персистентности и виремии .

(L) Величина эффекта, определяемая db-RDA частот иммунной популяции на фиг. 2, на дисперсию гена DE в толстой и тонкой кишке. Прямоугольники, обведенные черным контуром, указывают значение p <0,05.

Пермутационный многомерный анализ дисперсии после анализа главных компонентов (PCA) подтвердил, что транскрипционные ответы на вирусы значительно отличались от ответов в условиях GF и MDF и что каждый вирус индуцировал определенный паттерн экспрессии генов (рис. 4H-I и S5A- Б).Основными объясняющими переменными дисперсии между образцами снова были идентичность , за которой следует геном (фиг. 4J-K). Поскольку большая часть вариации транскриптома была необъяснимой, мы определили, коррелируют ли состав иммунных клеток и продукция цитокинов (описанные на фиг. 2 и 3) с различиями в экспрессии генов в разных условиях. Подмножества DC и T-клеток были основными объясняющими переменными и включали типы клеток с распознаваемыми функциями в противовирусных ответах, такие как Tbet ⁺ CD4 ⁺ T-клетки и pDC (рис.4L). Среди протестированных цитокинов только IL-22 был значимым объясняющим параметром (рис. S5C), вероятно, отражая роль этого цитокина в координации экспрессии антимикробных генов (Keir et al., 2020). В совокупности эти результаты хорошо коррелируют с нашими данными проточной цитометрии и выявляют реакции, общие для нескольких вирусов, а также подчеркивают важность исследования иммунных эффектов отдельных штаммов вирусов, которые невозможно предсказать, основываясь только на таксономических характеристиках.

Рисунок S5.Транскриптом ткани, индуцированный вирусной инфекцией

(A-B) PCA-кластеризация генов DE толстой (A) и тонкой кишки (B). Образцы, засеянные одним и тем же микробом, соединяют линиями с рассчитанными центроидами групп.

(C) db-RDA, указывающее величину индивидуального эффекта частот продукции цитокинов, полученную с помощью проточной цитометрии, в качестве объясняющих переменных вариации гена DE в толстой и тонкой кишке. Черные прямоугольники обозначают p <0,05.

Общая экспрессия кишечных генов и специфическая для отдельных вирусов

Затем мы идентифицировали специфические гены и пути, связанные с каждым вирусом индивидуально и с общими.Мы наблюдали 15 и три дифференциально регулируемых гена в толстой и тонкой кишке, соответственно, которые были общими, по крайней мере, для половины изученных вирусов, включая гены иммуноглобулинов Igha , Igkc , Iglc1 , Jchain и . Pou2af1 (рис. 5A-B). Этот результат согласуется с повышенной экспрессией генов, связанных с активацией В-клеток (рис. 4F-G), а также с предыдущими выводами о том, что MNV CR6 увеличивает локальную и системную продукцию антител у мышей GF и что продукция IgA часто наблюдается во время кишечных вирусных инфекций. (Blutt, Conner, 2013; Kernbauer et al., 2014).

Рисунок 5. Общая и специфическая для отдельных вирусов экспрессия кишечных генов

(AB) Тепловые карты, отображающие нормализованные значения экспрессии генов DE (среднее кратное изменение по GF≥2 и нескорректированное значение p≤0,01), модулированных по меньшей мере пятью вирусами в толстая кишка (A) и тонкий кишечник (B).

(CD) Тепловые карты, отображающие нормализованные значения экспрессии генов DE (среднее кратное изменение для GF≥1,5 и нескорректированное значение p≤0,01), аннотированные в GO: 0050829, GO: 0050830 и GO: 0061844 в толстой кишке (C) и тонкий кишечник (D).

(E-F) Анализ пути изобретательности (IPA) транскриптома толстой кишки инфицированных вирусом мышей для обогащения генов DE, участвующих в передаче сигналов IFN (E) или ключевых молекул в пути IFN (F).

(G-H) Гены DE толстой кишки (G) и тонкой кишки (H) анализировали с помощью IPA на наличие вышестоящих регуляторов. Показаны 10 основных вышестоящих регуляторов для каждого вируса с оценкой активации> 1.

Повышенная экспрессия антимикробных генов является признаком колонизации кишечника симбиотическими бактериями (Geva-Zatorsky et al., 2017; Hooper et al., 2001). Мы исследовали экспрессию антимикробных генов во время вирусной инфекции путем создания набора антимикробных генов, в котором гены аннотированы в GO: 0050829 (защитный ответ на грамотрицательные бактерии), GO: 0050830 (защитный ответ на грамположительные бактерии) и GO: 0061844 (антимикробный гуморальный иммунный ответ, опосредованный антимикробным пептидом) были объединены. Экспрессия многочисленных антимикробных генов была увеличена у инфицированных вирусом мышей по сравнению с контрольной группой GF (изменение ≥ 1,5 раза, p ≤ 0.01) (Рис. 5C-D). Однако общий ответ был не таким сильным, как вызванный MDF. Тем не менее, были транскрипты, индуцированные исключительно вирусами, включая маннозу-связывающий протеин C ( Mbl2 ) и интерферон-индуцируемые GTPases, Iigp1 , Irgm2 и Gbp2 .

MNV CR6, но не MNV CW3, укрепляет кишечный барьер, вызывая местный ответ IFN-I (Kernbauer et al., 2014; Neil et al., 2019). IFN-I (IFN-α и -β) и интерферон III типа (IFN-λ) представляют собой противовирусные цитокины, вырабатываемые в ответ на вирусную нуклеиновую кислоту, которые вызывают аналогичный набор интерферон-стимулированных генов (ISG), которые мы здесь вместе называем «подпись IFN».В соответствии с нашими предыдущими данными, колонизация MNV CR6, но не MNV CW3, была связана с сигнатурой IFN (рис. 5E). Удивительно, но ни один другой вирус из нашей панели не дал сигнатуры IFN, несмотря на высокие уровни вирусных нуклеиновых кислот, продуцируемых некоторыми из них, такими как MuAstV. Более того, только MNV CR6 был связан с повышенной транскрипцией регуляторов ISG (рис. 5F). Мы подтвердили, что экспрессия репрезентативных ISG Isg15 , Ifit1 и Oas1a была увеличена только у мышей, колонизированных MNV CR6 (рис.S6A).

Рисунок S6. Экспрессия генов, стимулированных интерфероном, и сигнатуры IL-22

(A) DESeq2, трансформированное количество указанных репрезентативных генов, стимулированных интерфероном (ISG) из РНК-Seq толстой кишки.

(B-C) Экспрессию гена в толстой кишке (B) и тонком кишечнике (C) мышей, инфицированных вирусом, анализировали на обогащение транскриптов, активированных в кишечнике мышей IL-22 — / — с помощью GSEA.

В отличие от IFN-I, IL-22 должен регулировать экспрессию генов DE для нескольких вирусов в зависимости от величины его влияния на вариабельность транскрипции (рис.S5C). Чтобы проверить это предсказание, мы использовали анализ обогащения набора генов (GSEA), чтобы определить, регулируются ли транскрипты, измененные в кишечнике Il-22 ^{— / —} мышей (Gronke et al., 2019), у инфицированных вирусом мышей по-разному. . Этот анализ подтвердил, что большинство инфицированных вирусом мышей производили сигнатуру IL-22. (Рис. S6B-C).

Мы использовали анализ пути изобретательности (IPA) для идентификации дополнительных регуляторов в следующих категориях: цитокин , лиганд-зависимый ядерный рецептор , трансмембранный рецептор , регулятор транскрипта и другие .В толстой кишке с такими регуляторами были связаны четыре вируса. Связанные с IFN факторы были основными регуляторами, связанными с CR6 MNV, тогда как MuAstV, MVMp и T1L активировали другие пути (рис. 5G). PRDM1, также известный как BLIMP1, является регулятором терминальной дифференцировки B-клеток (Shaffer et al., 2002) и влияет на транскрипционные ответы на MuAstV и T1L, поддерживая роль вирусов в развитии B-клеток. Связь MuAstV и фактора дифференцировки макрофагов CSF-1 согласуется с наблюдением, что у мышей, колонизированных MuAstV, наблюдалось увеличение макрофагов cLP (рис.2А). В тонком кишечнике гены, индуцированные провоспалительными цитокинами, такими как IL-1β, IFN-γ и TNF-α, были обогащены у мышей, инфицированных либо MVMi, либо RRV (фиг. 5H). Другие факторы, выявленные с помощью этого подхода, в некоторых случаях влияют на иммунитет. Например, инсулин (Ins1), который был связан с инфекцией MVMi, участвует с IFN-γ в петле обратной связи, способствуя эффекторному Т-клеточному ответу CD8 ⁺ на инфекцию цитомегаловируса мышей (Šestan et al., 2018). Следовательно, в дополнение к классическим ISG ниже IFN-I, которые мы наблюдаем для MNV CR6, вирусное воздействие индуцирует экспрессию генов, регулируемых рядом сигнальных молекул и путей, необходимых для иммунитета слизистой оболочки.

Кишечные транскриптомы мышей, инфицированных вирусом, обогащены сигнатурами генов бактериального микробиома

Мы использовали стратегию GSEA, аналогичную ранее описанному подходу (Godec et al., 2016), чтобы сравнить транскриптом инфицированных вирусом мышей с экспрессией генов. сигнатуры мышей, моноколонизированных с 53 отдельными видами бактериальной микробиоты (Geva-Zatorsky et al., 2017) (рис. 6A-D, таблица S3). Транскрипты толстой кишки мышей, колонизированных MDF, в нашем исследовании были положительно обогащены генами, активными в условиях избытка микробиоты (обычные мыши SPF) (Geva-Zatorsky et al., 2017), что указывает на соответствие положительных контролей (рис. 6А). Точно так же транскриптом тонкого кишечника мышей, колонизированных MDF, показал отрицательную оценку обогащения для генов, подавляемых у обычных мышей SPF (фиг. 6D). При использовании этого подхода 20 из 53 видов бактерий показали связь с одним или несколькими вирусами. Мы идентифицировали 91 пару вирус-бактерия, 60 из которых демонстрируют одинаковую направленность регуляции (т.е.положительное обогащение наборов бактериальных генов с повышенной регуляцией в вирус-ассоциированных транскриптах и ​​отрицательное обогащение наборов бактериальных генов с пониженной регуляцией в вирус-ассоциированных транскриптах) (рис.6A-D). Определенные наборы бактериальных генов показали исключительное спаривание с одним вирусом, как это наблюдалось с несколькими видами Bacteroides и Parabacteroides и T1L в толстой кишке. Это последовательное соединение между T1L и отрядом Bacteroidales предполагает, что этот вирус вызывает аналогичную реакцию на колонизацию этой прототипной группой комменсальных бактерий. Набор генов, индуцированный MNV CR6, также был спарен с множественными наборами генов с усиленной бактериальной регуляцией в толстой кишке. Мы наблюдали особенно сильное обогащение сигнатуры Enterococcus faecalis , факультативной анаэробной бактерии семейства Enterococcaceae (рис.6E).

Рисунок 6. Кишечные транскриптомы мышей, инфицированных вирусом, обогащены сигнатурами генов бактериального микробиома

(A-D) транскриптомов толстой кишки (A-B) и тонкой кишки (C-D) от инфицированных вирусом мышей по сравнению с сигнатурами экспрессии генов мышей, колонизированных бактериями, с помощью GSEA. Наборы генов, активируемые после колонизации бактериями, показаны в A и C; Наборы генов с пониженной регуляцией показаны на графике B и D.

(E) GSEA, показывающем обогащение набора генов с повышенной регуляцией E. faecalis в транскриптоме толстой кишки мышей, инфицированных MNV CR6.

(F-G) Иерархическая кластеризация частот иммунной популяции, описанная в таблице S4. Пурпурный: вирусы; темно-фиолетовый: MDF и GF из этого исследования; апельсин: бактерии; розовый: обычные SPF и GF от Geva-Zatorsky et al.

Наконец, мы сравнили наши данные кишечной проточной цитометрии с результатами, полученными на мышах, моноколонизированных бактериями (Geva-Zatorsky et al., 2017). Из-за различий в стратегиях стробирования и маркерах, используемых для идентификации типов клеток, мы ограничили наше сравнение 16 подмножествами иммунных клеток, которые были количественно определены аналогичным образом во всех наборах данных (Таблица S4).Иерархическая кластеризация с использованием z-оценок двух наборов данных показала, что группы GF из обоих наборов данных сгруппированы вместе, как и MDF из нашего исследования и SPF из Geva-Zatorsky et al (рис. 6F-G). Большинство бактерий и вирусов сгруппированы вместе с GF или в соседних кладах, отличных от MDF и SPF, что позволяет предположить, что вклад конкретной бактерии или вируса, когда они присутствуют отдельно, составляет лишь небольшую часть общего микробиотезависимого воздействия на состав иммунных клеток. Вирусы были разбросаны среди бактерий, а не сгруппированы вместе в одну кладу, что указывает на то, что вызванные вирусом изменения частот иммунных клеток не отражают единообразный иммунологический ответ на вирусы, отличный от вызываемого бактериями.

ОБСУЖДЕНИЕ

, 2009). Только один из 10 вирусов, выбранных для исследования, привел к болезни или смерти, что позволяет нам определить иммунные эффекты девяти вирусов в отсутствие болезни.

В процессе создания моделей вирусной инфекции мы сделали несколько наблюдений о динамике заражения.Во-первых, мы обнаружили, что нуклеиновая кислота некоторых вирусов остается обнаруживаемой в стуле или крови в течение длительного периода времени. В отличие от ретровирусов и герпесвирусов, у членов этих вирусных семейств неизвестно время задержки. Наблюдения за вирусными инфекциями кори показывают, что вирусные антигены и РНК могут сохраняться даже для вирусов, которые не устанавливают латентный период или не интегрируют копии ДНК в геном хозяина (Griffin, 2020). Для некоторых вирусов этот тип устойчивости может быть опосредован иммунным уклонением, как это предполагалось для MNV (Lee et al., 2019; Томов и др., 2017). Независимо от механизма, мы обнаружили, что микробиота оказывает сильное влияние на стойкость. Хотя лечение антибиотиками препятствует заражению некоторыми кишечными вирусами (Baldridge et al., 2015; Kernbauer et al., 2014; Kuss et al., 2011), наши данные показали, что не все вирусы выигрывают от присутствия бактерий. Важной целью на будущее является определение того, отражает ли эта устойчивость к инфекции у обычных мышей присутствие определенных автохтонных вирусов или бактерий в кишечнике (Ingle et al., 2019; Ши и др., 2019).

Наши проточные цитометрические и транскрипционные анализы хорошо коррелировали и подтверждают гипотезу о том, что бессимптомная колонизация кишечными вирусами имеет последствия для хозяина. Хотя каждый вирус был связан с уникальным иммунным профилем после пероральной инокуляции мышей GF, было несколько повторяющихся тем. Вирусная инфекция обычно способствует дифференцировке лимфоцитов, особенно созреванию Т-клеток и поляризации Th2. Лабораторные мыши обнаруживают дефицит зрелых Т-клеток из-за отсутствия контакта с инфекционными агентами в условиях SPF (Beura et al., 2016; Lin et al., 2020; Yeung et al., 2020). В этом контексте примечательно, что дикие мыши и мыши из зоомагазинов, которые имеют более зрелый компартмент лимфоцитов, являются серопозитивными в отношении вирусов, тесно связанных с вирусами из нашей панели (аденовирус, MNV, парвовирус, реовирус и ротавирус) (Beura et al. др., 2016). Эти распространенные кишечные вирусы могут способствовать созреванию иммунной системы в естественной среде.

Мы считаем примечательным, что иммунные эффекты данного вируса не могут быть объяснены только качественными характеристиками.Близкородственные вирусные штаммы вызвали различные ответы по большинству оцениваемых нами параметров. Состав нуклеиновых кислот вирусного генома (ДНК по сравнению с РНК) вносил скромный, но воспроизводимый вклад в дисперсию, тогда как распространение и устойчивость вируса, по-видимому, не объясняли различия между условиями. Соответственно, одно примечательное открытие заключалось в том, что изменения в иммунных клетках и паттернах экспрессии генов легко наблюдались у мышей, у которых вирусная нуклеиновая кислота больше не определялась. Если этот устойчивый эффект вирусов распространяется на людей, то при поперечных метагеномных исследованиях когорт пациентов не будет обнаружено потенциально значимых воздействий вирусов, имевших место до начала заболевания.Продольный анализ виромов у детей, генетически предрасположенных к T1D, выявил обратную связь между воздействием аденовируса и цирковируса в раннем возрасте с последующим появлением аутоантител в сыворотке крови (Vehik et al., 2019; Zhao et al., 2017). Таким образом, мы выступаем за проспективный и лонгитюдный отбор проб для исследований ассоциации вирома, когда это возможно.

Основываясь на наших предыдущих исследованиях с MNV, мы ожидали, что по крайней мере некоторые инфицированные вирусом мыши будут иметь сигнатуру IFN. Вместо этого мы наблюдали увеличение количества продуцирующих IL-22 клеток и опосредованного IL-22 паттерна экспрессии генов после заражения несколькими вирусами в нашей панели.IL-22 участвует в гомеостазе кишечника и экспрессии антимикробных генов (Gronke et al., 2019; Keir et al., 2020). Мы считаем возможным, что индукция IL-22 компенсирует ущерб, причиненный кишечными вирусами, тем самым облегчая комменсальные отношения.

Сравнение наших результатов с аналогичным набором данных, собранным с использованием бактериальной моноколонизации, выявило пары вирус-бактерия, которые стимулируют перекрывающиеся ответы хозяина. Например, E. faecalis и MNV CR6 имеют общую сигнатуру экспрессии гена толстой кишки, что повысило нашу уверенность в подходе, поскольку эти два инфекционных агента также обладают общей способностью обеспечивать защиту в модели повреждения кишечника DSS (Kernbauer et al., 2014; Нил и др., 2019; Takahashi et al., 2019; Wang et al., 2014). Некоторые из бактерий, вызывающих иммунный ответ, перекрывающийся с вирусами, вовлечены в заболевание, например Ruminococcus gnavus и Bacteroides vulgatus при ВЗК (Hall et al., 2017; Png et al., 2010; Rath et al., 1999). Будет интересно проверить роль совпадающих вирусов в моделях животных, в которых болезнь зависит от этих бактерий (Bloom et al., 2011; Ramanan et al., 2014, 2016; Yu et al., 2020).

Наше исследование было ограничено ограниченным числом вирусов, поэтому мы не смогли охватить огромное разнообразие вирусов, обнаруженных у людей. В отличие от бактерий, выделенных из кишечника человека, которые почти всегда колонизируют мышей GF, многие важные с медицинской точки зрения вирусы проявляют узкий видовой тропизм или измененную вирулентность при заражении мышей. Более широкий обзор вирусов, вероятно, позволит выявить дополнительные типы клеток и пути, на которые влияет вирусная инфекция. Еще одно ограничение заключается в том, что мы выбрали подход с одной инфекцией, чтобы определить прямые реакции и избежать упущенных иммунных эффектов, которые перекрываются с существующей микробиотой.Этот подход также позволил нашему in-silico сравнить индуцированные вирусом иммунные ответы с иммунными ответами, индуцированными у мышей, моноколонизированных бактериями.

Мы предполагаем две ситуации, в которых наши результаты могут служить ориентиром для исследований, изучающих, как кишечный виром модулирует иммунитет в присутствии бактерий. Во-первых, мышей, ассоциированных с определенной флорой, можно использовать для оценки иммунных эффектов отдельных бактерий в сложном сообществе (Fischbach, 2018). Этот синтетический экологический подход может включать вирусы с иммуногенным потенциалом из нашей группы, чтобы лучше отражать сложность реального микробиома.Во-вторых, мы выступаем за тестирование роли этих и других вирусов на животных моделях воспалительных заболеваний, многие из которых, как считается, зависят от бактериальных членов микробиоты. Хотя ответ Th2 на MNV CR6 несущественен у мышей C57BL / 6 дикого типа, мутация гена восприимчивости к IBD ATG16L1 сенсибилизирует эпителий кишечника к незначительному эффекту вирусной инфекции (Cadwell et al., 2010; Matsuzawa-Ishimoto и др., 2017). Наблюдения в исследованиях мутантных мышей, инфицированных MNV, позволили нам идентифицировать гомеостатические механизмы, участвующие в целостности барьера, которые сохраняются у людей (Cadwell et al., 2008; Мацузава-Ишимото и др., 2020). Таким образом, включение вирусов в модели генетических заболеваний может выявить жизненно важные пути, способствующие укреплению здоровья.

Наши результаты показывают, что эукариотические вирусы в кишечнике обладают недооцененной иммуномодулирующей способностью в дополнение к общепризнанной роли возбудителей гастроэнтерита. Реакция на вирусную инфекцию может быть полезной в соответствующих условиях, как продемонстрировали экспериментальные эксперименты, показывающие, что вводимые штаммы MNV и MuAstV профилактически защищают мышей от энтеропатогенных E.coli (Cortez et al., 2020; Neil et al., 2019). Прецедент манипуляций с виромом кишечника в терапевтических целях. Оральная полиовирусная вакцина обеспечивает перекрестную защиту от других патогенов, что было использовано в качестве обоснования для введения этого ослабленного вируса вместо инактивированной вакцины в эндемичных по полиомиелиту регионах (Upfill-Brown et al., 2017). Наши текущие исследования с использованием моделей на животных позволят в будущем оценить безопасность и эффективность вмешательств на основе вирома.

ВЗНОС АВТОРОВ

S.Д. и К.С. задумал исследование и разработал эксперименты. S.D. провели, проанализировали и интерпретировали все эксперименты. T.H. и A.R.V. помогли провести эксперименты по вирусной колонизации. J.A.N. помог разработать и интерпретировать данные, касающиеся MNV. S.Y.W. подготовили минимально определенную флору. J.J.B., K.U. и T.S.D. предоставил вирус T1L и помог разработать метод обнаружения T1L. К.С. руководил анализом и интерпретацией всех описанных экспериментов. S.D. и К. написал рукопись при участии всех авторов.

ЗАЯВЛЕНИЕ ОБ ИНТЕРЕСАХ

K.C. получает финансирование исследований от компаний Pfizer и Abbvie. К.С. консультировался или получал гонорар от Puretech Health, Genentech и Abbvie. К.С. имеет предварительные патенты, заявка на патент США. № 15/625 934 и 62/935 035.

Материал и методы

Мыши

GF C57BL / 6J были выведены в изоляторах с гибкой пленкой в ​​лаборатории Gnotobiotics Animal Facility Школы медицины Гроссмана Нью-Йоркского университета. Отсутствие фекальных бактерий подтверждалось ежемесячно путем оценки наличия ДНК 16S в образцах стула с помощью кПЦР, как описано ранее (Kernbauer et al., 2014). Для экспериментов мышей GF содержали в клетках Bioexclusion (Tecniplast) с доступом к стерильной пище и воде. Обычные мыши C57BL / 6J и Rag1 ^{— / —} были приобретены в лаборатории Джексона (Бар-Харбор, Мэн, США). Эксперименты, изображенные на фиг. 1, были выполнены на мышах GF обоих полов и обычных мышей-самцов. Эксперименты, изображенные на фиг. 2-5, были выполнены с использованием самок мышей GF. Каждый независимый эксперимент включал 8-12 мышей, и в каждый раунд включали необработанных мышей GF.Каждую микробную ассоциацию оценивали на 5-7 мышах по меньшей мере в 2 независимых экспериментах. Однопометники были случайным образом распределены в экспериментальные группы, и мышей никогда не содержали в одном помещении. Все исследования на животных проводились в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по уходу и использованию животных Института медицины Нью-Йоркского университета им. Гроссмана.

Производство вируса

Исходные образцы штаммов MNV CR6 и CW3 получали путем трансфекции клеток 293T (ATCC) плазмидами, содержащими вирусный геном (описанным в (Sutherland et al., 2018)) с использованием реагента для трансфекции ДНК X-tremeGENE ™ HP (Roche, Indianapolis, IN, USA). Супернатанты наносили на клетки RAW264.7 (ATCC) для двух раундов амплификации с последующим ультрацентрифугированием супернатанта и ресуспендированием в PBS, не содержащем эндотоксина (Corning, Corning, NY, USA), для создания вирусных запасов. Концентрацию исходного материала определяли с помощью анализа бляшек (описанного ниже) на клетках RAW264.7, покрытых DMEM (Corning) + 1% метилцеллюлоза (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США), и оценивали через 3 дня с использованием кристаллического фиолетового.

Исходный материал h4 штамма CVB3

получали путем трансфекции клеток HeLa (АТСС) плазмидами, содержащими вирусный геном и полимеразу Т7, подарком от доктора Пфайффера Дж. (Юго-западный Юта, Даллас, Техас, США), с использованием липофектамина 3000 (Thermo Fisher Scientific, Рочестер, Нью-Йорк, США). Клеточный лизат наносили на клетки HeLa для двух раундов амплификации. Затем клеточный лизат ресуспендировали в PBS + 1 мМ MgCl2 и 1 мМ CaCl2, замораживали / размораживали, супернатант собирали и использовали в качестве исходного вирусного материала.Исходный титр определяли с помощью анализа бляшек (описанного ниже) на клетках HeLa, покрытых MEM (Lonza, Walkersville, MD, USA) + 0,5% агарозы (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), и оценивали через 3 дня с использованием кристаллического фиолетового.

Клетки

MAdV1, MAdV2 и CMT93 были подарком доктора Смита Дж. Г. (Вашингтонский университет, Сиэтл, Вашингтон, США). Вирусы размножали на клетках CMT93, и супернатанты собирали и использовали в качестве вирусных запасов. Концентрацию исходных материалов определяли с помощью анализа формирования фокуса (описанного ниже) на клетках CMT93.

Подвой MuAstV-NYU1 был получен из стула мышей Rag1 ^{— / —} , выращенных в Медицинской школе Гроссмана Нью-Йоркского университета. Вкратце, стул мышей в возрасте 6-10 недель собирали и гомогенизировали в PBS. Суспензию фекалий осаждали, и супернатант дважды фильтровали, используя 0,22 мкм фильтрующий элемент Millex-GP, управляемый шприцем (MilliporeSigma, Burligton, MA, USA). Титр вируса определяли с помощью кПЦР после экстракции РНК и ретротранскрипции.

MVMi и MVMp были подарком доктора Пинтела Д. (Университет Миссури, Колумбия, Миссури, США), а клетки NB324K были подарком доктораТаттерсолл П. (Йельский университет, Нью-Хейвен, Коннектикут, США). Вирусы размножали на клетках NB324K, и либо клеточный лизат (MVMp), либо супернатант (MVMi) использовали в качестве исходных вирусов. Концентрацию исходных материалов определяли с помощью анализа формирования фокуса (описанного ниже) на клетках NB324K.

Клетки

RRV и MA-104 были подарком доктора Гринберга HB (Стэнфордский университет, Стэнфорд, Калифорния, США). Вирус размножали на клетках MA-104, и супернатант собирали и использовали в качестве вирусного исходного материала. Концентрацию исходного материала определяли с помощью анализа бляшек (описанного ниже) на клетках MA-104, покрытых M199 (Sigma-Aldrich) + 0.5% агарозы и оценивали через 5 дней с использованием нейтрального красного. Реовирус T1L получали, как описано (Sutherland et al., 2018). T1L определяли количественно с помощью анализа бляшек с использованием клеток L929, покрытых DMEM, содержащей 1% агар, и оценивали через 6 дней после окрашивания нейтральным красным (Sutherland et al., 2018).

Вирусная инокуляция

Вирусы вводили мышам через желудочный зонд в возрасте около 5 недель. Вводимые дозы составляли 3 × 10 ⁶ БОЕ / мышь для MNV CR6 и CW3; 1 × 10 ⁷ PFU / мышь для CVB3; 1 × 10 ⁶ FFU / мышь для MAdV1; 5 × 10 ⁴ FFU / мышь для MAdV2; 1 × 10 ¹⁰ копий генома на мышь для MuAstV; 2 × 10 ⁵ FFU / мышь для MVMi; 5 × 10 ⁶ FFU / мышь для MVMp; 2 × 10 ⁷ PFU / мышь для RRV; 1 × 10 ⁸ PFU / мышь для T1L.Для экспериментов, изображенных на фиг. 1, стул и кровь собирали перед инокуляцией вируса и через 2, 5, 10, 30 и 60 дней после инокуляции. Для экспериментов, изображенных на фиг. 2-5, стул собирали перед инокуляцией вируса и через 5 и 28 дней после инокуляции, тогда как кровь собирали через 28 дней после инокуляции.

Обработка образцов и экстракция нуклеиновых кислот

Образцы стула гомогенизировали в PBS для экстракции нуклеиновых кислот механическим разрушением циркониевыми шариками (BioSpec Products, Bartlesville, OK, USA) с использованием аппарата FastPrep-24 (MP Biomedicals, Solon, OH, СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ).Суспензию лизата центрифугировали при 2000 г, 5 мин, 4 ° C и супернатант снова центрифугировали при 8000 г, 5 мин, 4 ° C, чтобы полностью удалить остатки. Сегменты толстой и тонкой кишки механически разрушали в PBS с металлическими шариками (Qiagen) с использованием аппарата FastPrep-24. Затем суспензию лизата центрифугировали при 8000 g, 5 мин, 4 ° C для удаления остатков, и часть супернатанта использовали для экстракции РНК. ДНК очищали с использованием наборов DNeasy Blood & Tissue Kits (Qiagen) в соответствии с протоколом производителя.РНК очищали с использованием наборов для экстракции RNeasy (Qiagen) с инкубацией с ДНКазой (Qiagen) в соответствии с протоколом производителя. Для экстракции нуклеиновых кислот использовали 200 мкл гомогената PBS стула и 50 мкл крови. кДНК синтезировали с использованием набора ProtoScript First Strand cDNA Synthesis Kit (NEB) с использованием случайных праймеров в соответствии с протоколом производителя. Все продукты кДНК хранили при -20 ° C.

Количественное определение вирусов

Для анализа бляшек образцы серийно разводили в PBS или DMEM и использовали 500 мкл для наложения почти конфлюэнтных клеток в 6-луночных планшетах (Corning).Клетки инкубировали при 37 ° C и осторожно встряхивали каждые 15 минут. Через 1 ч инокулят удаляли и клетки покрывали полутвердой средой, описанной выше. По истечении указанного выше количества дней клетки либо фиксировали, добавляя PBS + 4% PFA (Sigma-Aldrich) в течение 1 ч, а затем окрашивали кристаллическим фиолетовым, либо инкубировали ON с PBS + 0,05% нейтрального красного (Sigma, St Louis, MO , США) и фиксировали PBS + 4% PFA в течение 1 ч.

Для анализов формирования фокуса образцы серийно разбавляли в PBS или DMEM и использовали 50 мкл для наложения почти конфлюэнтных клеток в 96-луночном многолуночном планшете с прозрачным дном черного цвета (Corning).Клетки инкубировали при 37 ° C и осторожно встряхивали каждые 15 минут. Через 1 ч инокулят удаляли и клетки покрывали DMEM + 10% фетальной бычьей сывороткой (GE Healthcare Life Science, Пискатауэй, Нью-Джерси, США). Через 1 день клетки фиксировали водой HyClone (GE Healthcare Life Science) + 2% PFA в течение 20 минут на льду, а затем пермеабилизировали буфером для гашения / химической завивки (20 мМ глицин, 0,25% TX-100 в PBS) в течение 20 минут. мин на льду. Затем клетки окрашивали первичным антителом в течение 1 ч на льду. Клон антиаденовирусного антитела 8C4 (Fitzgerald Industries) использовали для обнаружения MAdV1 и MAdV2), и ранее описанное некоммерческое антитело против белка NS α-MVM (Yeung et al., 1991, подарок доктора Таттерсалла П.) был использован для обнаружения МВМ. Затем мы окрашивали в течение 15 минут на льду вторичным α-мышиным IgG AF488 (Thermo Fisher Scientific) и DAPI (Sigma-Aldrich). Планшеты получали с помощью системы визуализации клеток EVOS (Thermo Fisher Scientific), а единицы формирования фокуса подсчитывали вручную с помощью ImageJ (NIH).

Количественное определение вирусной нуклеиновой кислоты проводили на образцах ДНК и кДНК с использованием LightCycler 480 SYBR Green I Master или LightCycler 480 Probes Master (Roche), а абсолютное количество рассчитывали путем сравнения с внутренними линеаризованными стандартами плазмид.Последовательности праймеров и зондов представлены в таблице S5.

Тест нейтрализации уменьшения образования бляшек

Сыворотка была извлечена из крови, взятой из подчелюстной вены через 20-30 дней после заражения вирусом. Сыворотку, инактивированную в течение 30 минут при 56 ° C, разводили в PBS и такое же количество вируса добавляли во все условия до 1 ч инкубации при 37 ° C. Затем эту смесь использовали в качестве инокулята для анализа бляшек и анализа формирования фокуса, которые выполняли, как описано ранее.

Обработка органов

Толстую кишку, тонкий кишечник, брыжеечные лимфатические узлы, легкие и селезенку собирали у необработанных мышей GF или мышей GF через 28 дней после инокуляции вирусами и бактериями.

Сегмент дистального отдела толстой кишки (4 мм длиной и 3 см от прямой кишки) и три сегмента средней части двенадцатиперстной кишки, тощей кишки и подвздошной кишки (каждый длиной 2 мм) собирали и хранили при -80 ° C до тех пор, пока Выделение РНК. Дополнительно, 3 мм от дистального отдела толстой кишки и от подвздошной кишки собирали и фиксировали в формалине (Thermo Fisher Scientific) для гистологического анализа.

Для суспензии единичных клеток ткани тонкой кишки и толстой кишки промывали PBS, удаляли жир и пятна Пейера, а ткани сначала инкубировали с 20 мл HBSS (Gibco) с 2% HEPES (Corning), 1% пируватом натрия. (Corning), 5 мМ ЭДТА и 1 мМ дитиотреитол (Sigma-Aldrich) в течение 15 минут при 37 ° C, а затем с новыми 20 мл HBSS с 2% HEPES, 1% пируватом натрия, 5 мМ EDTA в течение 10 минут при 37 °. С.Кусочки ткани промывали HBSS + 5% FCS, измельчали ​​и затем ферментативно расщепляли коллагеназой D (0,5 мг / мл, Roche) и ДНКазой I (0,01 мг / мл, Sigma-Aldrich) в течение 30-45 мин при 37 ° C. при постоянном помешивании. Расщепленные растворы пропускали через сетчатые фильтры для клеток (BD) размером 70 мкм и клетки подвергали градиентному центрифугированию с использованием 40% Percoll (Sigma-Aldrich).

IEL были выделены из жидкой фазы первой инкубации тонкой кишки, промыты PBS и подвергнуты градиентному центрифугированию с использованием 40% Percoll.

мл собирали и пропускали через сетчатые фильтры для клеток 100 мкм и ресуспендировали в PBS.

Легкие и селезенки были грубо измельчены и ферментативно расщеплены коллагеназой D (0,5 мг / мл) и ДНКазой I (0,01 мг / мл) в течение 20-30 минут при 37 ° C. Расщепленные растворы пропускали через сетчатые фильтры для клеток 100 мкм, ресуспендировали в буфере ACK для лизиса эритроцитов и ресуспендировали в PBS.

Для анализа продукции цитокинов клетки помещали в RPMI с 10% FBS и обрабатывали форбол 12-миристат 13-ацетатом (50 нг / мл, MilliporeSigma) и иономицином (1 мкг / мл, MilliporeSigma) в присутствии из GolgiStop (BD) и GolgiPlug (BD) в течение 4 часов при 37 ° C.

Проточная цитометрия

Клетки предварительно инкубировали с блоком CD16 / CD32 Fc (BD PharMingen). Окрашивание поверхностных и внутриклеточных цитокинов выполняли в соответствии с инструкциями производителя в PBS + 2% FBS в течение 20 минут на льду. Использовали три панели для окрашивания. Первая панель включала антитела против BST2, NK1.1, THY1.2, F4 / 80, CD103, LY6C, CD11b, MHC-II, CD45, CD11c, CD19, CD64 и B220. Чтобы окрашивать образцы селезенки, мы заменили CD103 на CD8a для лучшей оценки субпопуляций дендритных клеток.Вторая панель включала антитела против GATA3, CD11b, CD11c, GR1, CD19, TER119, Tbet, TCRγδ, FOXP3, CD8, CD4, RORγt, CD62L, CD127, NK1.1, CD44, CD3ε, CD45. Третья панель включала антитела против IFN-γ, CD11b, CD11c, GR1, CD19, TER119, Nk1.1, Il-22, TCRγδ, GRANZYME B, IL-17a, CD8, CD4, IL-10, CD127, IL-4. , CD3Ε, CD45. Образцы фиксировали либо буфером фиксации (Biolegend, Сан-Диего, Калифорния, США), либо набором буферов для окрашивания eBioscience Foxp3 / фактора транскрипции (Thermo Fisher Scientific). Для внутриклеточного окрашивания фактора транскрипции клетки пермеабилизировали с помощью набора буфера для окрашивания eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set при комнатной температуре в течение 30 минут в присутствии антител.Для внутриклеточного окрашивания цитокинов клетки пермеабилизировали промывочным буфером для пермеабилизации внутриклеточного окрашивания (Biolegend) при комнатной температуре в течение 30 минут в присутствии антител. Набор Zombie UV Fixable Viability Kit (Biolegend) использовался для исключения мертвых клеток. Образцы собирали на BD LSR II (BD Biosciences) и анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo (Treestar, Inc., Ashland, OR, США).

Глубокое секвенирование РНК

CEL-seq2 было выполнено на 67 образцах РНК толстой кишки и 60 образцах РНК тонкой кишки.Секвенирование выполняли на Illumina NovaSeq 6000 (Illumina). Все образцы из одних и тех же органов были секвенированы вместе, поэтому корректировка эффекта партии не требовалась.

Микроскопия ткани кишечника

Ткани тонкой кишки и толстой кишки разрезали по длине, прикрепляли булавками на черном воске и фиксировали в 10% формалине. Ткани помещали в 3% агар с низкой температурой плавления (Promega, Мэдисон, Висконсин, США). Заливка формалином, разрезание и окрашивание гематоксилином и эозином выполнялись центром гистопатологии Нью-Йоркского университета.Срезы получали либо на микроскопе Leica SCN400 F (Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA).

Бактерии

Минимально определенная флора состояла из 15 бактерий, описанных в Brugiroux et al., 2016. Akkermansia muciniphila YL44 был подарком доктора Маккой К. (Университет Калгари, Канада), и он был выращен на 0,1% муцин (Sigma-Aldrich), анаэробный, 37 ° C. Bacteroides caecimuris I48 был получен из DSMZ и выращивался в BHI (Anaerobe Systems,), анаэробно, 37 ° C. Muribaculum Кишечник YL27 (DSMZ) выращивали в среде с измельченным мясом (Anaerobe Systems), анаэробной, 37 ° C. Turicimonas muris был подарком доктора Маккой К., он был выращен в BHI, анаэробно, при 37 ° C. Escherichia coli Mt1B1 (DSMZ) выращивали в LB (Sigma-Aldrich), аэробно, 37 ° C. Bifidobacterium longum subsp. animalis YL2 (DSMZ) выращивали в BHI, анаэробно, 37 ° C. Staphylococcus xylosus 33ERD13C (DSMZ) выращивали на дрожжах TSB (Sigma Aldrich), аэробных условиях, 37 ° C. Streptococcus danieliae ERD01G (DSMZ) выращивали на TSB-дрожжах, микроаэрофильных, 37 ° C. Enterococcus faecalis KB1 (DMSZ) выращивали на дрожжах TSB, аэробных условиях, 30 ° C. Acutalibacter muris KB18 (DSMZ) выращивали в BHI, анаэробно, 37 ° C. Clostridium clostridioforme YL32 (DSMZ) выращивали в PYG (Anaerobe Systems), анаэробно, 37 ° C. Flavinofractor plautii YL31 (DSMZ) выращивали в PYG, анаэробно, 37 ° C. Blautia coccoides YL58 (DSMZ) выращивали в среде с измельченным мясом, анаэробно, 37 ° C. Lactobacillus reuteri I49 (DMSZ) выращивали в микроаэрофильной среде MRS при 37 ° C. Clostridium innocuum I46 (DSMZ) выращивали в среде с измельченным мясом или PYG, анаэробно, 37 ° C.

Yersinia Pseudotubercolosis был подарком доктора Дарвина А. (Нью-Йоркский университет), и его выращивали в течение ночи в бульоне Лурия-Бертани при встряхивании при 28 ° C. Утром бактерии пересевали в свежий бульон Лурия-Бертани при встряхивании при 28 ° C до OD 0,7-0,9. Плотность бактерий подтверждали посевом для разведения.Самкам мышей GF в возрасте 9 недель прививали через желудочный зонд 2 × 10 ⁴ КОЕ, ресуспендированных в 200 мкл PBS. Тяжесть заболевания определялась количественно с помощью системы баллов, в которой отдельные мыши получали оценку 1 в случае наличия видимой крови в стуле и от 0 до 2 из следующих: сутулость и диарея.

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы хотим поблагодарить доктора Джули Пфайффер (Юго-западный Юта), доктора Джейсона Г. Смита (Вашингтонский университет), доктора Дэвида Пинтела (Университет Миссури), доктораПитеру Таттерсоллу (Йельский университет), доктору Гарри Б. Гринбергу (Стэнфордский университет) и доктору Кэти Маккой (Университет Калгари) за то, что они поделились с нами реагентами и дали советы по методам культивирования. Мы хотели бы поблагодарить Школу медицины проточной цитометрии и сортировки клеток, микроскопии, геномной технологии и гистологии Школы медицины Нью-Йоркского университета за использование их инструментов и техническую помощь (частично при поддержке Национальных институтов здравоохранения [NIH], гранты P31CA016087, S10OD01058 и S10OD018338).Мы также хотим поблагодарить Марджи Альва, Хуана Карраскильо и Беатрис Дельгадо за техническую помощь с гнотобиотиками. Это исследование было поддержано грантами NIH DK093668 (KC), AI121244 (KC), HL123340 (KC), AI130945 (KC), R01 AI140754 (KC), F31 DK108562 (JJB), T32 HL007751 (JJB), R01 AID038296.